Лада 115: Купить LADA (ВАЗ) 2115 с пробегом: продажа автомобилей Лада 2115 б/у в Москве

Базовая автокраска Lada 115

Автоэмаль разбавляется универсальными либо акриловыми растворителями для базовых покрытий.
Пропорции смешивания от 2:1 до 1:1.
Пропорции зависят от выбранной системы подбора, а так же технических характеристик окрашивающего оборудования.

Межслойная выдержка от 5 до 30 минут в зависимости от температуры и влажности воздуха.
Перед нанесением лака не более 8 часов.
Визуально о высыхании краски свидетельствует матовение.
Непосредственно после нанесения, база выглядит глянцевой, после испарения растворителя из эмали она становится матовой.

Итак, сначала заглянем в сервисную книжку — в ней должен быть вкладыш с данными авто, среди которых будет код краски. Если в сервисной книжке вы не нашли этот вкладыш, то узнать цвет можно из шильдика с технической информацией на кузове авто.

1. обезжирить антисиликоном.
2. если есть ржавчина, зачистить до металла.
3. загрунтовать.
4. покрасить.
5. если краска базовая, необходимо через 15 мин после покраски покрыть лаком

Все необходимые матриалы: (краска, лак, грунт, антисиликон и т.д.) вы можете приобрести у нас. Лучше всего для устранения царапины на автомобиле Lada подойдет набор BrushLine.

Lada 115

Год: 2004

Тема: Автомобили

Серия: АвтоВАЗ

Страна: Россия

Город: Тольятти

Изображение: ВАЗ-2115 «Лада-Самара»

Заказчик: АвтоВАЗ

Типография: ДИС ОАО «Автоваз»

Поверхность (материал): Бумага

Теги: ВАЗ, Легковая

Новости Лада (АвтоВАЗ) – Страница 115

«АвтоВАЗ» готовится начать серийное производство LADA Vesta Sport29 мая 2018, 06:46Российский автопроизводитель «АвтоВАЗ» готовится к запуску серийного производства спортивного седана LADA Vesta Sport‍. Об этом свидетельствует зарегистрированное в Роспатенте название модели 24 мая.

«АвтоВАЗ» запускает серийное производство LADA Vesta Sport28 мая 2018, 20:03Крупнейший российский автомобильный концерн «АвтоВАЗ» в ближайшее время начнет серийное производство «заряженного» седана LADA Vesta Sport. Право интеллектуальной собственности на название модели уже зарегистрировано в Роспатенте.

«АвтоВАЗ» разрабатывает новый внедорожник27 мая 2018, 10:53Крупнейший российский автомобильный концерн «АвтоВАЗ» выпустит новый кроссовер или внедорожник в 2021—2022 годах. Об этом рассказал журналистам сам глава компании Николя Мор, который покинет свой пост уже 1 июня.

«АвтоВАЗ» разрабатывает новый внедорожник, но сохранит выпуск Lada 4х426 мая 2018, 18:37Новый полноприводный внедорожник Lada, который разрабатывает «АвтоВАЗ», появится в 2021-22 годах и будет выпускаться параллельно с классической Lada 4×4.

Универсалы Lada Vesta SW и SW Cross получили премию «Топ-5 Авто»25 мая 2018, 08:42Новые универсалы LADA Vesta SW и SW Cross стали лауреатами престижной премии экспертов автомобильного бизнеса в категории «Лучшие компактные городские автомобили». Как заявили в пресс-службе «АвтоВАЗа», церемония вручения наград состоялась 23 мая.

Компания «АвтоВАЗ» возобновила продажи в Чили спустя 20 лет24 мая 2018, 12:43Крупнейший российский автомобильный концерн «АвтоВАЗ» возобновил экспорт автомобилей в Чили после 20-летнего перерыва. Согласно плану, объем реализации наших машин на чилийском рынке к концу 2018 года должен составить порядка 400 автомобилей LADA.

В апреле сегмент российских легковых машин вырос на 29%24 мая 2018, 03:32На российском рынке растут продажи легковых автомобилей отечественного производства. Так, в апреле текущего года было реализовано 33.6 тыс. таких машин, что на 29.2% больше, чем за тот же период 2017 года.

Чеченская молодежь сожалеет о прекращении производства Lada Priora23 мая 2018, 06:55Председатель Союза чеченской молодежи Рустам Тапаев выразил сожаление в связи с решением российского автогиганта «АвтоВАЗ» прекратить производство модели Lada Priora‍. Об этом он сообщил в интервью радиостанции «Говорит Москва».

АвтоВАЗ прекращает производство Lada Priora22 мая 2018, 17:30Крупнейший российский автомобильный концерн «АвтоВАЗ» снимет с производства автомобили LADA Priora в июле этого года. Об этом он сообщил в официальном письме к своим дилерам.

Официальные дилеры ЛАДА (ВАЗ)

1

Санкт-Петербург, 4-й Верхний переулок д.1.А , (812) 565-30-47

Прагматика Парнас — официальный дилер LADA. Продажа новых автомобилей. Сервисное обслуживание гарантийный и послегарантийный ремонт. Весь спектр дополнительного оборудования.

2

Санкт-Петербург, ул. Уральская д.33 лит. Б, (812) 565-30-58

Прагматика Василеостровский — официальный дилер автомобилей LADA в Санкт-Петербурге. У нас Вы получите уникальные условия на покупку всех моделей LADA сможете оформить кредит или сдать свой автомобиль по системе Трейд-Ин.

3

Санкт-Петербург, ул. Руставели д. 27 , (812) 331-0-332

Автоцентр «Лада-центр Ручьи» — ООО «Строительная компания» является официальным дилером по продаже автомобилей ВАЗ в Северо-Западном регионе. Продажа автомобилей Лада в Санкт-Петербурге. Скидки. Акции. Спецпредложения.

4

Санкт-Петербург, Коломяжский пр. д.30 , (812) 309-42-20

Официальный дилер автомобилей LADA. Новые автомобили. Автомобили с пробегом. Взаимозачет. Кредит. Лизинг. Страхование. Сервис. Дополнительное оборудование. Автозапчасти.

5

Санкт-Петербург, Выборгское шоссе д.31 корп.2 лит.А, (812) 999-99-99

Компания ООО «Р-Моторс ЛАДА» является официальным дилером LADA. Продажа новых автомобилей. Сервисное обслуживание.

6

Санкт-Петербург, Пулковское шоссе д.70, (812) 999-99-99

Компания ООО «Р-Моторс Лада» является официальным дилером LADA. Продажа новых автомобилей. Сервисное обслуживание.

7

Санкт-Петербург, ул. Маршала Захарова д.41 лит.A, (812) 999-99-99

Компания ООО «Р-Моторс Лада» является официальным дилером LADA. Продажа новых автомобилей. Сервисное обслуживание.

8

Санкт-Петербург, Кингисеппское шоссе д.50, (812) 777-79-77

Официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ» и ЗАО «Джи Эм-АВТОВАЗ». Продажа новых автомобилей LADA (Лада ВАЗ) Chevrolet Niva (Шевроле Нива). Обмен автомобилей на новые. Кредит. Все виды страхования.

9

Санкт-Петербург, ул. Малая Балканская д.57, (812) 640-91-96

Официальный дилер АВТОВАЗ. Продажа автомобилей LADA. Гарантия 5 лет. Cервис — гарантийный ремонт — кузовные и малярные работы — запчасти — сигнализация — аудио — антикор — тонирование стекол — мойка — химчистка салона.

10

Санкт-Петербург, ул. Бухарестская д.22 корп.3, (812) 416-99-83

ООО «ФАВОРИТ» — Дилерский Центр LADA осуществляет полный спектр услуг по продаже и сервисному обслуживанию / кузовному ремонту автомобилей LADA. Продажа автомобилей с пробегом.

11

Москва, Новорижское шоссе 9 км от МКАД, (495) 780-55-33

Major Auto — официальный дилер LADA в Москве. Продажа новых автомобилей. Автосервис. Кредит. Страхование. Трейд-ин. Тест-драйв.

12

Москва, Нововладыкинский проезд д.2 стр.1, (495) 995-22-55

Автосалон «Авто Алеа» входит в группу компаний «АЛЕА» — официальный дилер LADA. Продажа новых автомобилей. Тест-драйв.

13

Москва, Каширское шоссе д. 41 стр. 2, (495) 785-44-71

Компания АвтоГЕРМЕС — официальный дилер LADA (Лада). Продажа и ремонт автомобилей. Гарантийное техническое обслуживание.

14

Москва, Варшавское шоссе д.125 стр. 1В, (495) 228-03-41

Компания АвтоГЕРМЕС — официальный дилер LADA (Лада) SSANGYONG (Сан Янг) UAZ (УАЗ). Продажа и Ремонт автомобилей. Гарантийное техническое обслуживание.

15

Москва, ул. Сормовская д.21А, (495) 228-03-41

Компания АвтоГЕРМЕС — официальный дилер LADA (Лада) Ravon (Равон) UAZ (УАЗ) LIFAN (Лифан). Продажа и Ремонт автомобилей. Гарантийное техническое обслуживание.

16

Москва, Дмитровское шоссе д.161А, (495) 228-03-41

Компания АвтоГЕРМЕС — официальный дилер LADA (Лада) Ravon (Равон) FAW (Фау) Chery (Чери) УАЗ. Продажа и ремонт автомобилей. Гарантийное техническое обслуживание.

17

Москва, шоссе Энтузиастов д.59, (495) 228-03-41

Компания АвтоГЕРМЕС — официальный дилер: Mitsubishi (Мицубиси) LADA (Лада) RAVON (Равон) UAZ (УАЗ) Lifan (Лифан) FAW (Фау) Chery (Чери). Гарантийное техническое обслуживание. Ремонт.

18

Москва, ул. Красная Сосна д.3 стр. 1, (495) 228-03-41

Компания АвтоГЕРМЕС — официальный дилер LADA (Лада) Ravon (Равон) UAZ (УАЗ). Продажа и ремонт автомобилей. Гарантийное техническое обслуживание.

19

Москва, МКАД 78 км д. 2 корп. 4, (495) 602-02-02

Официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ». В наличии полный модельный ряд автомобилей Лада (Lada) всех цветов и комплектаций.

20

Москва, 14 км МКАД (внешняя сторона) г.Котельники Коммерческий пр-д д.8 стр. 1, (495) 363-00-20

Компания ТЕХИНКОМ имеет статус официального дилера одного из самого популярного автомобильного бренда среди российских автолюбителей — LADA.

21

Москва, МКАД 88 километр вл.2 стр.1 — внешняя сторона, (495) 230-77-55

ТОРГМАШ Официальный дилер Lada. Продажа новых автомобилей. Сервисное обслуживание. Кредит. Тест-драйв. Трейд-ин.

22

Московская обл, г. Подольск пр. Юных Ленинцев д. 1и стр.2, (495) 276-20-20

ААА АВТОРУСЬ ПОДОЛЬСК — официальный дилер завода «АвтоВАЗ». Осуществляет продажу транспортных средств марки LADA. Широкий пакет дополнительных услуг. Сервисное обслуживание.

23

Московская обл, г. Химки Вашутинское шоссе д.6, (495) 575-35-95

ООО «АвтоТехИнвест» — официальный дилер АВТОВАЗ. Весь модельный ряд. А/м в наличии и под заказ. Действуют акции и скидки.

24

Московская обл, г. Пушкино ул. Ярославское шоссе д. 2В, (499) 135-00-35

ООО «Алан-Авто» является официальным дилером ОАО «Автоваз». В наличии автомобили LADA самых различных цветов и комплектаций – Вы определенно сможете найти то что нужно именно Вам.

25

Московская обл, Яхрома Шлюзовой пер. д.1, (495) 229-4-229

ОАО «Яхрома-Лада» — является уполномоченным представителем ОАО «АВТОВАЗ». Продажа и обслуживание автомобилей LADA. Сервис. Гарантия. Кредит. Автозапчасти. Полный комплекс услуг связанных с приобретением и эксплуатацией автомобилей LADA.

26

Архангельск, ул. Октябрят д.31, (8182) 42-14-24

Официальный представитель АвтоВАЗ в Архангельском регионе. Продажа. Сервисное обслуживание. Гарантийное обслуживание.

27

Архангельск, ул. Гайдара д.63 ТЦ Астра Авто, (8182) 46-42-00

ООО «Алгоритм-Сервис» — официальный представитель LADA (ОАО «АВТОВАЗ») в Архангельске. Продажа автомобилей ЛАДА. Сервисное обслуживание. Гарантийное обслуживание.

28

Астрахань, 1-й проезд Рождественского д.6, (8512) 48-28-28

Компания ООО «Аксион» — официальный дилер АВТОВАЗ (Lada). Продажа новых автомобилей. Для всех автомобилей предпродажная подготовка. Качественный сервис и гарантийное обслуживание.

29

Астрахань, ул. Н.Островского д.148, (8512) 23-80-12

Автосалон «Колесо» официальный дилер LADA Астрахани и Астраханской области. Продажа новых автомобилей. Сервисное обслуживание.

30

Барнаул, Змеиногорский тракт д.118Б, (3852) 28-24-24

Автоцентр АНТ — официальный дилер АВТОВАЗ (Lada). Продажа ВАЗ. Гарантийное и сервисное обслуживание. Рынок подержанных автомобилей АНТ.

31

Белгород, пр. Богдана Хмельницкого д.209, (4722) 35-73-73

Официальный дилер LADA в Белгородской области. Продажа новых автомобилей. Всегда в наличии весь модельный ряд автомобилей LADA.

32

Брянск, ул. Культуры д.1А, (4832) 55-55-55

Автосалон «Брянск-Лада» является дилером «АвтоВАЗ» по Брянску и Брянской области. Продажа автомобилей LADA. Гарантийное обслуживание. Прием предварительных заказов на автомобили соответствующих цветов и комплектаций. Кредит.

33

Великий Новгород, ул. Московская д.57, (8162) 70-40-70

Автоцентр «Новгород-Лада» — официальный дилерский центр LADA. Продажа новых автомобилей. Техническое обслуживание. Страхование. Кредит. Trade-in

34

Владимир, ул. Электрозаводская д.6 А, (4922) 43-17-77

ООО «Успех-Автосервис» является официальным дилером СП «GM-АВТОВАЗ» и ВАЗ (LADA) в г. Владимире. Продажа и обслуживание автомобилей Шевроле-NIVA и Лада.

35

Владимир, ул. Куйбышева д.24 А, (4922) 45-33-09

«Лада АвтоТракт» — официальный дилер автомобилей LADA. Продажа новых автомобилей. Полная комплексная техническая диагностика. Кредитные программы. Страхование. Услуга обмена автомобиля с пробегом на новый — TRADE-IN.

36

Волгоград, ул. Азизбекова д.73, (8442) 319-777

Официальный дилер ОАО «АвтоВАЗ». Продажа новых автомобилей LADA. Техническое обслуживание. Запасные части.

37

Волгоград, проезд Тайшетский д.4, (8442) 722-722

Автоцентр АГАТ-АВТО — официальный дилер LADA в Волгограде. Продажа. Сервис. Гарантия. Кредит. Лизинг. Утилизация.

38

Вологда, ул. Железнодорожная д.50 В корп. 1, (8172) 55-95-95

ГК «Автоэкспресс-Плюс» — автосалон «Лада Центр Вологда» — официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ». Осуществляет продажу автомобилей запчастей и установку дополнительного оборудования а также послепродажное обслуживание автомобилей LADA.

39

Вологда, ул. Гагарина д.66, (8172) 53-55-88

ООО «Мартен Вест» входит в состав ГК Мартен и является официальным дилером LADA. Продажа новых автомобилей ЛАДА. Автосервис. Кредит. Запчасти. Тест-драйв.

40

Воронеж, пр. Патриотов д.47, (473) 200-80-08

Официальный дилер автомобильных марок LADA / Lifan / Derways Hower (Great Wall) / FIAT Professional (коммерческие авто). Продажа новых автомобилей. Кредит и лизинг. ТО и Сервис. Гарантия.

41

Воронеж, ул. Остужева д.41, (473) 200-71-46

Группа компаний «БорАВТО» официальный дилер ВАЗ (LADA) / Chevrolet NIVA (GM-AVTOVAZ). Продажа и сервисное обслуживание. Кредит. Страхование. Пробные поездки.

42

Воронеж, Воронежская область г. Борисоглебск ул. Матросовская д.127, (47354) 51-155

Официальный дилер ВАЗ. Продажа гарантийное и послегарантийное обслуживание автомобилей.

43

Воронеж, ул. Независимости д.84-а, (473) 264-34-64

Официальный дилер LADA в Воронеже. Продажа обслуживание автомобилей. Продажа запчастей и аксессуаров. Кузовные работы.

44

Екатеринбург, ул. Металлургов д. 69, (343) 302-38-58

Автоцентр «Автовек» — официальный дилер автомобилей ВАЗ (Лада). Автосервис. Кредитование. Лизинг. Страхование.

45

Екатеринбург, ул. Фронтовых бригад д. 27, (343) 344-32-00

Официальный дилер LADA GM AvtoVAZ Ravon и УАЗ в Екатеринбурге. Вы сможете приобрести автомобили в наличии в Екатеринбурге или под заказ.

46

Екатеринбург, Свердловская обл. г.Березовский ул. Кольцевая д.4 стр.2, (343) 228-38-80

ООО «Березовский Лада-Центр» является официальным дилером ОАО «АВТОВАЗ» входит в состав ГК «Березовский привоз» крупнейшего в УрФО автомобильного комплекса.

47

Екатеринбург, ул. Маневровая д.40, (343) 302-38-91

Официальный дилер LADA в Екатеринбурге. Продажа новых автомобилей. Кредит. Сервис.

48

Екатеринбург, Свердловская обл. г. Каменск-Уральский ул. Ленина д.2, (3439) 39-99-95

Официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ». Полный модельный ряд автомобилей LADA. Гарантийное и техническое обслуживание. Установка дополнительного оборудования.

49

Екатеринбург, ул. Шефская д.116 а, (343) 301-99-88

ООО ТСАЦ «Июль» — официальный дилер LADA. Продажа автомобилей LADA. Техническое обслуживание. Гарантийный ремонт. Установка дополнительного оборудования. Страхование. Кредит на месте. Лизинг.

50

Иваново, ул. Загородная д.22, (4932) 900-000

ООО «Автоэкспресс-Плюс» — официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ». Осуществляет продажу автомобилей LADA. Запчасти и установка дополнительного оборудования. Послепродажное обслуживание автомобилей LADA.

51

Ижевск, ул. Коммунаров д.381 , (3412) 90-23-90

«Русская Ладья» — официальный дилер LADA в Удмуртской Республике. В автосалоне представлен большой выбор автомобилей Lada в наличии и под заказ.

52

Казань, пр. Победы д. 202, (843) 272-99-58

Официальный дилер ОАО “АВТОВАЗ”в Казани. Продажа автомобилей ВАЗ (в т.ч. 21093). Кредит. Страхование. Лизинг. Дополнительное оборудование. Антикор. Шиномонтаж. Автомойка.

53

Казань, ул. Кожевенная д.46 за речным техникумом, (843) 554-15-41

ООО «Парус» является официальным дилером ОАО «АВТОВАЗ» «ИЖ – АВТО» «CHERY Motors» «TATA Motors Ltd» «BAW Fenix Motors Co». Продажа и техническое обслуживание автомобилей.

54

Калуга, ул. Резванская д.6 (м-рн Аннени), (4842) 21-20-40

Официальный дилер LADA и LADA Sport. Сервис. Гарантийное и постгарантийное обслуживание. Весь модельный ряд автомобилей. Кредит. Запасные части и аксессуары.

55

Киров, ул. Труда д.90, (8332) 407-222

Автосалон «Гусар» (ЗАО «Маркетинг-Бюро») — официальный дилерский центр LADA в Кирове. Продажа автомобилей LADA. Гарантийное и сервисное обслуживание. Продажа оригинальных запчастей и аксессуаров. Тест-драйв. Трейд-ин.

56

Киров, ул. Карла Маркса д.4, (8332) 222-888

Автосалон «Лада Центр Киров» — официальный дилер автомобилей LADA в Кирове и Кировской области. Продажа новых автомобилей. Техническое обслуживание. Запчасти и дополнительное оборудование. Страхование. Кредит.

57

Киров, ул. Пугачева д.32, (8332) 56-59-99

Официальный дилер АвтоВАЗ. Полный комплекс услуг связанных с приобритением и эксплуатацией автомобилей.

58

Кострома, ул. 2-я Волжская д.7, (4942) 323-311

Автоцентр «Вираж» имеет статус официального дилера следующих автомобильных марок ВАЗ ГАЗ УАЗ ТагАЗ Chery. Своим клиентам автоцентр дает возможность приобрести автомобили с индивидуальным набором опций.

59

Краснодар, Ростовское шоссе д.14/3, (861) 212-51-51

Официальный дилер LADA. Продажа новых автомобилей LADA. Гарантийное и сервисное обслуживание. Запчасти. Trade-in.

60

Краснодар, ул. Аэропортовская д.37 (хутор им. Ленина п/о 37 корп. А), (861) 200-25-15

ТРАНСФОР Кубань — официальный дилер ЛАДА. Мы готовы предложить Вам весь модельный ряд автомобилей ЛАДА.

61

Краснодар, ул. Уральская д.136/3, (861) 224-22-00

«Юг-Авто» — официальный дилер LADA в Краснодаре. Весь модельный ряд LADA в наличии и с ПТС.

62

Красноярск, ул. 4-я Шинная д.20, (391) 266-98-99

Официальный дилер ОАО «АвтоВАЗ» в Красноярске. В 2009г. Продажа новых автомобилей LADA. Гарантийное обслуживание.

63

Курск, ул. 50 лет Октября д.124, (4712) 57-07-07

«Курск-Лада» является официальным дилером и одним из лидеров продаж продукции LADA на территории Курской области.

64

Магнитогорск, ул. Магнитная д.160 , (3519) 54-13-18

ООО «Сильвер-Авто ГРУПП» — официальный дилер LADA и CHEVROLET в Магнитогорске. Продажа новых автомобилей. Сервис. Кредит.

65

Мурманск, пр. Кольский д. 110, (8152) 69-02-70

Официальный дилер LADA в Мурманске. Продажа. Сервис. Гарантия. Запасные части.

66

Нефтекамск, ул. Янаульская д.14, (34783) 20-92-9

ЗАО «Нефтекамск — Лада» — официальный дилер ОАО АвтоВаз в республике Башкортостан. Весь модельный ряд автомобилей семейства ВАЗ в наличии и под заказ. Установка дополнительного оборудования по желанию клиента.

67

Нижний Новгород, ул. Новикова-Прибоя д.2, (831) 259-56-59

Дилерский центр LADA. Кредит. Страхование. Доп.оборудование. Trade-in. Гарантийное и постгарантийное обслуживание.

68

Нижний Новгород, ул. Коминтерна д.43, (831) 274-44-44

Предприятие является генеральным представителем ОАО «АВТОВАЗ» в Нижегородском регионе и входит в крупнейший в России автодилерский холдинг «Лада-Сервис».

69

Нижний Новгород, Нижегородская обл. г. Арзамас ул.Ленина д.110 Д, (83147) 2-55-99

ООО «ТСС-Арзамас » — официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ» специализируется на продаже автомобилей LADA и их техническом и гарантийном обслуживании на собственном СТО. Автозапчасти.

70

Нижний Новгород, пр. Гагарина д.121 Д, (831) 422-11-11

Официальный дилер LADA — дважды обладатель престижной премии «Автодилер года» (организатор аналитич. аг. «Автостат»). Более 500 автомобилей в наличии! Широкий выбор нестандартных спортивных моделей спецтехники. Сервисное обслуживание и ремонт.

71

Нижний Новгород, Нижегородская обл. г.Дзержинск пр. Ленина д.107б, (8313) 25-33-33

Официальный дилер LADA в г. Дзержинске Нижегородской обл. с 1997 года. Крупнейший автосалон в городе осуществляющий продажу новых автомобилей LADA (в наличии более 200 автомобилей). Сервисное обслуживание.

72

Новокузнецк, ул. Обнорского д.41, (3843) 91-00-45

Официальный дилер ОАО «АвтоВаз». Торговля а/м LADA. Торговля запасными частями от производителя. Ремонт. Гарантийное и техническое обслуживание а/м.

73

Новокузнецк, ул. Автотранспортная д.43А, (3843) 200-076

«Запсиб-Лада» — официальный дилер LADA осуществляет продвижение марки LADA в г.Новокузнецке. Продажа а/м. СТО. Продажа автозапчастей.

74

Новосибирск, Академгородок ул. Русская д.48, (383) 330-03-03

Автосалон АВТО-1 — АВТОВАЗ и ДЖИ-ЭМ АВТОВАЗ. Мы предлагаем весь модельный ряд автомобилей ЛАДА (ВАЗ) а также автомобили CHEVROLET — ШЕВРОЛЕ НИВА. Тюнинг центр.

75

Новосибирск, ул. Хилокская д.9, (383) 287-00-00

Официальный дилер ВАЗ УАЗ SsangYong в Новосибирске. Весь модельный ряд отечественных и корейских автомобилей. Просторный шоу-рум. Современная сервисная станция с командой профессиональных механиков. Новый склад запасных частей широкий ассортимент.

76

Оренбург, Оренбургская область г.Орск Новотроицкое шоссе д. 62, (3537) 28-88-88

Весь спектр услуг по продаже автомобилей Chevrolet Оpel Lada SsangYong Lifan УАЗ. А также реализации автомобилей по системе Trade-in и качественному сервисному обслуживанию автомобилей всех марок.

77

Оренбург, ул. Волгоградская д.5, (3532) 44-88-63

«Лада-Сервис» является официальным дилером «АвтоВАЗ». Реализует продукцию автозавода и оказывает услуги населению по гарантийному и постгарантийному обслуживанию автомобилей LADA.

78

Пермь, Бродовский тракт д.9, (342) 246-26-06

Официальный дилер LADA в Пермском крае. Салон по продаже автомобилей и станция технического обслуживания LADA компании «ДАВ-АВТО».

79

Петрозаводск, Комсомольский пр. д.8, (8142) 53-33-60

Автоцентр «Петрозаводск-Лада» — официальный дилерский центр LADA. Продажа новых автомобилей. Техническое обслуживание. Запчасти и аксесуары. Страхование. Кредит.

80

Петрозаводск, Лососинское шоссе д. 39, (8142) 44-44-00

Фирма «Слово» — официальный дилер KIA Motors FIAT Fiat Professional SsangYong ЛАДА UAZ ГАЗ ISUZU и Mitsubishi FUSO в Республике Карелия.

81

Псков, ул. Леона Поземского д.112, (8112) 70-10-70

ОАО «Псков-Лада» — официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ» в Псковской области. Продажа автомобилей LADA. Гарантийный ремонт автомобилей. Техническое обслуживание. Продажа автозапчастей.

82

Псков, Псковская обл. г.Великие Луки ул. Гоголя д.4, (81153) 9-55-65

ОАО «Псков-Лада» — официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ» в Псковской области. Продажа автомобилей LADA. Гарантийный ремонт автомобилей. Техническое обслуживание. Продажа автозапчастей.

83

Ростов-на-Дону, ул. Таганрогская д.211, (863) 297-55-55

Официальный дилер АВТОВАЗ. Продажа новых автомобилей LADA юридическим и физическим лицам по наличному и безналичному расчету. Предпродажная подготовка. Сервисные услуги.

84

Ростов-на-Дону, Ростовская обл. г.Аксай пр. Аксайский д.7, (863) 200-09-20

Компания «Кристалл» является официальным дилером ОАО «АВТОВАЗ» в Ростове-на-Дону. Продажа и обслуживание автомобилей LADA. Сервисный центр.

85

Ростов-на-Дону, Ростовская обл. г. Аксай ул. Западная д.37 (федеральная трасса М4-Кавказ), (863) 268-88-88

Компания «Темп Авто» является официальным дилером автомобилей Лада ГАЗ Hyundai. Продажа и сервис грузовой техники.

86

Рязань, Московское шоссе д.65 В, (4912) 77-73-35

Официальный дилер ВАЗ. Продажа и техническое обслуживание автомобилей ЛАДА. Гарантийное и послегарантийное обслуживание.

87

Рязань, ул. Есенина д.1Б (выезд на Солотчу), (4912) 95-55-44

Официальный дилер LADA. Продажа и техническое обслуживание автомобилей. Гарантийное и послегарантийное обслуживание.

88

Рязань, ул.Бирюзова д.1 Г, (4912) 70-17-07

ООО Автосалон «Канищево» — официональный региональный дилер ОАО «Автоваз». Продажа новых автомобилей марки LADA всех модификаций. Установка автосигнализаций. Антикоррозийная обработка. Предпродажная подготовка.

89

Самара, Заводское шоссе д.14 корп.1 , (846) 979-75-55

ООО «Автоцентр на Заводском» является официальным дилером ОАО «АВТОВАЗ». В автосалоне представлен полный модельный ряд автомобилей LADA (Лада ВАЗ).

90

Самара, ул. Мирная д.3, (846) 269-22-22

Автосалон «Самара-Авто» официальный дилер ОАО «Автоваз». Реализация новых автомобилей ВАЗ (Лада). Различные цвета и комплектации. Цены завода изготовителя. ПТС в наличии. Индивидуальный подход к каждому клиенту. Возможно приобретение автомобиля в кредит.

91

Самара, ул. Алма-Атинская д.72, (846) 331-00-00 многоканальный

ОАО Самара-Лада — это дистрибьютор АвтоВАЗа и специализированный дилерский центр европейского уровня GM-AVTOVAZ. Продажа и обслуживание автомобилей Lada Chevrolet Niva.

92

Саранск, пгт Зубова Поляна ул. Парцинская д.49а, (83458) 218-48

Официальный дилер ВАЗ (LADA). Гарантийное обслуживание. Продажа новых автомобилей. Сервисное обслуживание. Утилизация.

93

Саратов, ул. Орджоникидзе д.131 А, (8452) 47-00-00

ПремьеКар – официальный дилер «LADA» является частью автомобильной группы Премье. Продажа автомобилей «LADA». Гарантийное / послегарантийное обслуживание и ремонт. Продажа оригинальных запасных частей «LADA» и аксессуаров.

94

Саратов, ул. Спартака д.15, (8452) 57-07-58

Официальный дилер ОАО АВТОВАЗ. Продажа автомобилей LADA за наличный и безналичный расчет. Широкий выбор цветов и комплектаций. Кредит.

95

Симферополь, ул. Оленчука д.52, +7(978) 076-32-00

Компания Техно-Сервис К — официальный дилер отечественных брендов ВАЗ и УАЗ в Республике Крым. Продажа новых автомобилей. Сервисное обслуживание.

96

Ставрополь, пр. Кулакова д.39, (8652) 39-79-79

ООО «Вершина-Лада» — официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ» 2-ой категории. Продажа автомобилей Lada. Кредит. Страхование а/м. Тюнинг. Установка дополнительного оборудования.

97

Ставрополь, ул. Доваторцев д.62, (8652) 77-70-92

Официальный дилер ОАО «АВТОВАЗ». Продажа новых автомобилей LADA. Оказание услуг по ремонту сервисному обслуживанию. Кредит. Технические характеристики и цены на весь модельный ряд.

98

Сургут, ул. Маяковского д.53, (3462) 51-21-21

Форвард-Авто (Сургут) — официальный дилер LADA 1й категории в Сургуте.

99

Тверь, ул. Малые Перемерки д.42, (4822) 481-222

Компания «АвтоГрад» — официальный дилер LADA. Продажа новых автомобилей. Техническое обслуживание. Кредитование. Страхование.

100

Тверь, ул. Коробкова д.5, (4822) 77-78-78

«Норд-Авто» — официальный дилерский центр LADA. Продажа новых автомобилей по системе «Trade in». Автосервис.

101

Тверь, автодорога Москва-Санкт-Петербург 165 км СТО, (4822) 73-84-52

РУМОС Лада — официальный дилер ЛАДА в Твери. Программа Трейд-ин. Большой выбор кредитных программ. Специальный предложения сделают покупку автомобиля легкой и выгодной.

102

Тольятти, Южное шоссе д.113, (8482) 75-91-52 — ВАЗ

Официальный дилер « АВТОВАЗа» и СП «Джи-Эм АВТОВАЗ». Продажа автомобилей ВАЗ Chevrolet Niva Chevrolet Viva. Услуги автосервиса. Trade-in. Тест-Драйв.

103

Тольятти, ул.Транспортная д.3 , (8482) 37-00-00

Официальный дилер ОАО АВТОВАЗ. ПРОДАЖА автомобилей ВАЗ.

104

Тула, ул. Рязанская д.7, (4872) 71-05-75

ОАО ПКФ «Тулаавтосервис» является официальным дилером LADA. Предлагаем своим клиентам весь комплекс услуг в сфере продаж новых автомобилей LADA.

105

Тула, пос. Горелки Московское шоссе д.2Н, (4872) 33-74-20

Официальный дилер LADA. Мы предлагаем новые автомобили. Все автомобили имеют гарантию качества и хорошо приспособлены к условиям российских дорог.

106

Тюмень, ул. Чекистов д.31 , (3452) 27-47-50

Тюмень-АВТОВАЗ — официальный дилер LADA в г. Тюмень (Тюменская область). Продажа новых автомобилей и автомобилей с пробегом. Тест-драйв. Гарантийное и сервисное обслуживание. Кредитование.

107

Ульяновск, Московское шоссе д.17К, (8422) 27-12-12

ООО «АвтоРай»- официальный дилер «АВТОВАЗ». Продажа новых автомобилей Лада. Автосервис. Гарантийный ремонт. Тест-драйв.

108

Ульяновск, пр. Созидателей д.27, (8422) 25-01-01

Симбирск-Лада — официальный дилер LADA Ульяновской области. Продажа новых автомобилей. Сервисные услуги.

109

Уфа, ул. Рубежная д.166, (347) 246-06-00

Официальный дилерский центр LADA. Продажа новых автомобилей. Продажа автомобилей с пробегом. Установка дополнительного оборудования. Страхование. Кредитование. Гарантия.

110

Уфа, ул. Интернациональная д.20, (347) 216-36-67

Автосалон «Луидор-Уфа» — официальный дилер АвтоВАЗа на территории Башкирии. Вся линейка автомобилей Lada. Гарантийное и постгарантийное обслуживание. Ремонт и сервисное обслуживание автомобилей.

111

Челябинск, ул. Труда д.22 , (351) 264-96-96

Официальный дилер LADA. Продажа и обслуживание автомобилей. Современные станции — мастерские технического и сервисного обслуживания.

112

Челябинск, Свердловский тракт д.7/2, (351) 225-70-51

Автотехцентр «Акцент-Авто М» в Челябинске является филиалом сети «Сатурн» которая специализируется на продаже гарантийном и сервисном обслуживании автомобилей LADA. «Акцент-Авто М» является официальным дилером ОАО «АВТОВАЗ».

113

Челябинск, ул. Молодогвардейцев д.2, (351) 792-93-79

Официальный дилер АвтоВАЗ. Автомобили Lada. Продажа. Кредит. Сервис. Гарантия. Автозапчасти. Масла и химия оптом и в розницу. Автосигнализации: установка и продажа. Аудиоаппаратура: установка и продажа.

114

Череповец, Северное шоссе д. 20, (8202) 20-16-20

Официальный дилер автомобилей LADA в городе Череповец. Продажа новых автомобилей. Сервис. Запасные части.

115

Ярославль, Московский пр. д.110, (4852) 20-88-88

Автофирма «Светлана» — официальный дилер LADA. Продажа новых автомобилей и автомобилей с пробегом. Техническое обслуживание автомобилей LADA. Гарантийное обслуживание автомобилей. Кредитование. Страхование. Выкуп. Trade-in.

Фотогалерея, полная информация о модели …

Компьютер Gamma GF 115T на Лада Самара 2

Описание маршрутного компьютера Gamma GF 115T

Маршрутный бортовой компьютер Gamma GF 115T – это первая модель бортового компьютера для автомобилей ВАЗ 2113-14-15 и ВАЗ 2108-09-099 от производителя Ferrum-Group.

Следующими моделями серии БК для автомобилей семейства Лада Самара и Лада Самара 2 являются компьютеры Gamma GF 215T, Gamma GF 315T и Gamma GF 415T.

Устанавливается  бортовой компьютер GF 115T  в специально отведённое место под маршрутный компьютер, которое есть во всех выше указаных автомобилях. Выполнен GF 115T в чёрном корпусе и оснащён текстовым двухстрочным дисплеем либо с синей, либо с зелёной подсветкой. Управляется БК с помощью 4 кнопок, которые расположены слева и справа от дисплея. Текстовый индикатор 16 символов 2 строки оптимизирован по углу обзора.

Подключается GF 115T  просто,  благодаря подробной инструкции по подключению и эксплуатации, которая прилагается в комплекте с изделием. В автомобилях Лада Самара 2 уже есть готовая фишка для подключения маршрутного компьютера, а значит для полного функционирования БК необходимо поключить еще провод К-линии в колодку диагностики для считывания данных с контроллера ( ЭБУ ).

Оснащён GF 115T следующим набором функций:

• диагностические параметры: поиск, расшифровка и удаление ошибок системы, распознавание версии контроллера и т.д.
• маршрутные параметры: средняя скорость за поездку, мгновенный расход топлива, средний расход топлива, прогноз пробега на оставшемся топливе, количество топлива в баке, время поездки и многое другое.
• аварийный сигнализатор всегда вовремя предупредит Вас об опасном напряжении бортовой сети, о низком уровне масла в двигателе, о превышении установленного скоростного режима, об опасной температуре охлаждающей жидкости и т.д.
• сроки ТО приятно подскажут Вам, когда следует заменить масло в двигателе, масло в КПП, тормозные колодки, ремень ГРМ и другое.

В сравнении с другими БК GF 115T отличается отсутствием речевого информатора, но выигрывает за счёт высокой надёжности, простотой использования и приемлемой ценой. Бортовые компьютеры Gamma отличаются хорошим качеством за умеренную плату. Это значит, что выбирая, GF 115Т для своего автомобиля вы приобретайте, надёжного помощника на каждый день. 

Генератор для автомобилей Лада 2108-21099 100А LG 0108 2108-37701010 2108-3701010 2108-3701010-04 372.3701-02 372.3701000-02 372.3701 372.3701Р 2108-3701010-05

Amazon.com: Первый лад 115 Аксессуары для скрипки: Музыкальные инструменты

• Вес упаковки: 0.3 фунта
• Тип продукта: Детали и аксессуары для инструментов
• Кол-во в упаковке: 1
• Размеры упаковки: 17,78 см (Д) X 5,08 см (Ш) X 0,762 см (В)

Дактилоскопия одномолекулярных пептидов | PNAS

Значение

Секвенирование белков остается сложной задачей для небольших образцов.Чувствительная технология секвенирования создаст возможность для одноклеточной протеомики и скрининга в реальном времени для медицинской диагностики на месте. Чтобы определить идентичность белков, мы ранее разработали вычислительный алгоритм, который анализирует упорядоченную последовательность только двух типов аминокислот в пределах одного вида белка. Путем модификации биологической наномашины мы разработали технологию флуоресценции одиночных молекул для линеаризации белковых молекул и упорядоченного считывания сигналов от меченых аминокислот.Это доказательство концепции дактилоскопии одиночных молекул откроет путь к секвенированию одномолекулярных белков и проложит путь к разработке нового, быстрого и надежного диагностического инструмента.

Abstract

Протеомные анализы предоставляют важную информацию о молекулярных путях клеточных систем и состоянии живого организма. В настоящее время масс-спектрометрия — это лучший выбор для протеомного анализа. Однако потребность в большом количестве образцов затрудняет мелкомасштабное протеомное исследование.Здесь мы демонстрируем доказательство концепции фингерпринтинга одномолекулярных белков на основе FRET. Мы использовали AAA + протеазу ClpXP для сканирования пептидов. Используя меченный донорным флуорофором ClpP, мы последовательно считываем сигналы FRET от меченных акцептором аминокислот пептидов. Перепрофилированный ClpXP демонстрирует однонаправленную обработку с высокой процессивностью и имеет потенциал для обнаружения белков с низким содержанием. Наша методика является многообещающим подходом для секвенирования белковых субстратов с использованием небольшого количества образца.

Протеомные анализы предоставляют важную информацию о молекулярных путях клеточных систем и состоянии живого организма (1). Следовательно, для понимания биологических процессов и их (дис) регуляции, в том числе болезни, критически важно контролировать белковый состав клеток путем секвенирования (то есть определения аминокислотной последовательности). В настоящее время масс-спектрометрия является первым методом секвенирования белков. Однако масс-спектрометрический анализ часто не позволяет распознать второстепенные виды, встроенные в другие доминирующие виды, поскольку предсказание последовательности осуществляется путем анализа сложных спектральных пиков (2).Поскольку многие клеточные белки существуют в небольшом количестве (3), сложно получить крупномасштабную протеомную информацию. Секвенирование ДНК представляет аналогичные проблемы, но их можно решить путем амплификации образцов ДНК до достижения высокого отношения сигнал / шум. Это решение не может быть применено для анализа белков, поскольку не существует естественного механизма, который мог бы амплифицировать белки.

Одномолекулярные методы могут предоставить радикально новые инструменты для секвенирования белков, которые могут количественно определять клеточные белки с такой же высокой точностью, как и при масс-спектрометрии, при этом требуя небольших количеств образцов, таких как одна ячейка.Однако, несмотря на несколько недавних исследований (4-8), истинное секвенирование одномолекулярных белков еще не достигнуто из-за сложности, которая возникает из-за первичных последовательностей белков. В то время как ДНК состоит только из четырех строительных блоков (A, G, C, T), белки состоят из 20 различных аминокислот. Независимо от выбранного метода считывания, полное секвенирование белка потребует обнаружения 20 различимых сигналов, что до сих пор не было продемонстрировано при обнаружении одиночных молекул.Недавно наша и еще одна команда с помощью вычислений продемонстрировала, что считывание только части из 20 строительных блоков достаточно для идентификации белков на уровне одной молекулы (9, 10). Короче говоря, количество видов белков в организме конечно и предсказуемо. Посредством сравнения на основе биоинформатики с протеомными базами данных упорядоченное обнаружение только двух типов аминокислот может позволить идентифицировать белок. Например, упорядоченное обнаружение остатков цистеина и лизина, которые можно модифицировать с использованием ортогональных химических методов, достаточно для секвенирования протеома человека (10).Мы назвали этот подход «фингерпринтингом одномолекулярных белков», чтобы отличить его от полного секвенирования белка. Здесь мы демонстрируем доказательство концепции технологии дактилоскопии одной молекулы, которая считывает флуоресцентно меченые аминокислоты синтетических пептидов и модельного клеточного белка.

Чтобы получить упорядоченное определение флуоресцентно меченых аминокислот, нам понадобился молекулярный зонд, который может сканировать пептид процессивным способом. Мы взяли на вооружение существующий в природе молекулярный аппарат, протеазу AAA + ClpXP из Escherichia coli .Белковый комплекс ClpXP представляет собой ферментативный мотор, который разворачивает и разрушает белковые субстраты. Мономеры ClpX образуют гомогексамерное кольцо (ClpX ₆ ), которое может проявлять большую механическую силу для разворачивания белков с помощью гидролиза АТФ (11, 12). Посредством итерационных раундов генерирующих силу ударов мощности ClpX ₆ перемещает субстраты через центр своего кольца процессивным способом (13, 14), с обширной неразборчивостью в сторону неестественных модификаций субстратов, включая флуоресцентные метки (15-17).Белковые субстраты распознаются ClpX ₆ , когда они отображают специфические неупорядоченные последовательности, такие как 11-аминокислотный C-концевой тег ssrA (18). ClpX ₆ нацеливается на субстраты для деградации, подавая их в ClpP ₁₄ , гомотетрадекамерную протеазу, которая содержит 14 сайтов расщепления и самособирается в бочкообразный комплекс, который охватывает центральную камеру (19).

Результаты

Платформа для снятия отпечатков пальцев на одной молекуле.

Чтобы иммобилизовать ClpXP (ClpX ₆ P ₁₄ ) для визуализации одиночных молекул, мы биотинилировали ClpX ₆ и связали ClpX ₆ P ₁₄ с кварцевой поверхностью, покрытой PEG, посредством конъюгации биотина и стрептавидина ( Инжир.1 А ). Комбинация флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) и визуализации с переменным лазерным возбуждением (ALEX) (20, 21) использовалась для мониторинга индивидуальных комплексов ClpXP, которые связываются, перемещаются и разлагаются субстратов, меченных красителем, в режиме реального времени.

Одномолекулярное наблюдение транслокации ClpXP. ( A ) Схема платформы для снятия отпечатков пальцев одной молекулы. Меченный донором ClpXP иммобилизуется на предметном стекле, покрытом ПЭГ, посредством конъюгации биотин-стрептавидин.ClpX ₆ распознает субстрат с акцепторной меткой (K-38-C _Cy5 -ssrA, таблица S1) и перемещает его в камеру ClpP ₁₄ , в которой происходит FRET. ( B ) Типичная временная диаграмма флуоресценции. ( i ) Донорный сигнал исходит от Cy3-меченного ClpXP ( верхний график ) при возбуждении зеленым (532 нм). ( ii , зеленый прямоугольник) Внезапное появление акцепторного сигнала (время ~ 16 с) во время прямого акцепторного возбуждения красным цветом (633 нм) свидетельствует о связывании меченного акцептором субстрата с ClpXP ( средний график ).( iii , красный прямоугольник) Высокий FRET (время ~ 17 с) указывает на присутствие субстрата в ClpP ₁₄ (кривые верхний и нижний ). ( iv ) Потеря сигнала флуоресценции указывает на высвобождение субстрата. Стрелка в момент времени ∼40 с указывает на фотообесцвечивание Cy3. ( C ) FRET-распределение стадии iii ( n = 239). ( D ) Распределение времени пребывания на стадии iii ( n = 239).

Для обнаружения прохождения флуоресцентно меченых аминокислот через поры ClpX ₆ с точностью до нанометра мы использовали FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера) (22–24). Мы использовали два разных типа модельных субстратов для снятия отпечатков пальцев — короткие синтетические пептиды и небольшой белок (домен тайтина I27). Эти субстраты были помечены акцепторными флуорофорами, а также к ним был добавлен тег ssrA. Мы сконструировали сканер FRET, добавив флуорофор (донор) в камеру ClpP ₁₄ (рис.1 А ). Мы ввели цистеины в остаток Q48 ClpP (ClpP _Q48C ), A139 (ClpP _A139C ) или F31 (ClpP _F31C ), пометили их флуорофорами, функционализированными малеимидом (рис. S1 A ), и оценили пригодность для обнаружения субстрата на основе FRET. ClpP _Q48C и ClpP _A139C показали более высокий FRET, чем ClpP _F31C (рис. S1 B ). Среди первых двух, ClpP _Q48C был выбран для нашего финального сканера из-за его более высокой эффективности мечения флуорофора ( методы ).

Донорные флуорофоры на ClpP _Q48C расположены недалеко от центра камеры ClpP ₁₄ , что на ∼12 нм от портала входа субстрата ClpX ₆ (рис. S1 A ) (25, 26). Это расстояние больше, чем радиус Ферстера стандартной пары FRET из одной молекулы (∼5 нм). Это физическое разделение позволило нам выборочно детектировать сигналы только от флуорофоров (акцепторов) на белковом субстрате, которые были перемещены через центральный канал ClpX ₆ .Мы получили временные кривые FRET, сообщающие о транслокации, как показано на фиг. 1 B , путем представления меченого пептидного субстрата иммобилизованным комплексам ClpXP. Внезапное появление акцепторного сигнала во время прямого возбуждения акцептора указывало на связывание меченного акцептором пептида с ClpXP (фиг. 1 B , средний след , стадия ii ). Последующее появление высокого состояния FRET указывало на перемещение субстрата с помощью ClpX ₆ в камеру ClpP ₁₄ (рис.1 B , стадия iii ). При использовании медленно гидролизуемого аналога АТФ (ATPγS) вероятность появления высокого FRET снижалась на один порядок величины (рис. S2 D ). Потеря сигнала FRET происходила после высвобождения меченного красителем пептидного фрагмента (фиг. 1 B , стадия iv ). Когда использовался ингибитор расщепления [диизопропилфторфосфат (DFP)] (27) (рис. S2 A и B ), время пребывания высокого FRET увеличивалось в 3,5 раза (рис.S2 C ).

Наша концепция дактилоскопии одной молекулы требует определения порядка флуорофоров на единственном субстрате. Чтобы продемонстрировать фингерпринтинг, мы функционализировали пептид одним типом флуорофора (Cy3) на N-концевом сайте и вторым типом флуорофора (Cy5) на внутреннем цистеиновом остатке. Мы отслеживали порядок, в котором два флуорофора прошли через меченный Alexa488 ClpP ₁₄ (рис. 2 A ). Положения флуорофоров Cy3 и Cy5 относительно тега ssrA на субстрате должны определять порядок сигналов Alexa488-Cy3 FRET и Alexa488-Cy5 FRET, поскольку субстрат, меченный ssrA, перемещался через ClpX ₆ , начиная с его С-конца. .Фиг.2 B изображает характерную временную кривую, полученную с подложки ( _Cy3 NH ₃ -17-C _Cy5 -ssrA). Одновременное появление сигналов Cy3 и Cy5 при прямом возбуждении с длиной волны 532 нм и 637 нм (рис.2 B , Средний и Нижний , t ∼ 40 с, указано стрелками) указывает на связывание субстрата, содержащего оба ярлыка. На графике FRET (рис. 2 B , Top ) Alexa488-Cy5 FRET (отмечен * на графике времени) наблюдался до Alexa488-Cy3 FRET (отмечен °).Это наблюдение подтверждает, что фингерпринтер ClpXP считывает субстрат с ssrA-меткой от С-конца к N-концевому сайту.

Дактилоскопия одиночных молекул. ( A ) Субстраты с двумя акцепторными красителями метили на N-конце и на остатках цистеина (Таблица S1). Зеленая звезда обозначает Cy3, красная — Cy5, а синяя — Alexa488. ( B ) Типичная временная диаграмма для _Cy3 -NH ₃ -17-C _Cy5 -ssrA из трехцветного ALEX ( Top ) показала FRET между Alexa488 и Cy3; и Alexa488 и Cy5 при возбуждении синим лазерным светом (473 нм).Параллельные сигналы от Cy3 ( Средний ) и Cy5 ( Нижний ) при прямом возбуждении, соответственно, с зеленым (532 нм) и красным (637 нм). Для наглядности произвольное смещение 200 у.е. был применен к трассировке Alexa488, и сумма сигналов Cy3 и Cy5 была нанесена на график ( Средний ). Исходный график см. На рис. S1 E . Символ * обозначает Alexa488-Cy5 FRET. Символ ° обозначает Alexa488-Cy3 FRET. Стрелки указывают начало и конец каждого FRET. ( C ) Сравнение времени пребывания акцепторов.Время пребывания Cy5 (Δτ _Cy5 ) было вычтено из Cy3 (Δτ _Cy3 ) для каждого события из _Cy3 -NH ₃ -17-C _Cy5 -ssrA (серый) ( n = 318). Среднее значение распределения составляет 3,5 ± 4,90 (с). Белым цветом показан тот же анализ для _Cy5 -NH ₃ -17-C _Cy3 -ssrA ( n = 610). Среднее значение распределения составляет -3,9 ± 5,67 (с). ( D ) Подложки, помеченные одним акцепторным красителем. Остатки цистеина субстратов (K-38-C-ssrA) метили либо Cy3, либо Cy5.Зеленая звезда обозначает Cy3, красная — Cy5, а синяя — Alexa488. ( E ) График времени от подложек в D . В момент времени ~ 20 с, субстрат, меченный Cy3, связывается ( Top , Alexa488-Cy3 FRET) и при прямом возбуждении на длине волны 532 нм ( Middle ). В момент времени ~ 50 с меченный Cy5 субстрат связывается ( Top , Alexa488-Cy5 FRET) и при прямом возбуждении 637 нм ( Bottom ). Вычет 200 у.е. применяется к Alexa488. ( F ) Процент обработанных субстратов, меченных Cy3, наносили на график против ожидаемого процента субстратов, меченных Cy3.Линия является линейной (наклон 0,98 ± 0,02, точка пересечения 0,58 ± 0,79, R ² = 0,99). Точки данных взяты из 100-секундных записей, повторенных 10 раз для каждого условия (каждое n = 24,4 ± 1,50, всего n = 1194).

Мы применили эту схему фингерпринтинга к домену тайтина I27. Мы пометили два остатка Cys тайтина (Cys64 и Cys80) акцепторными флуорофорами. Поскольку у нас не было контроля над тем, какие красители были присоединены к каким остаткам Cys, мы пометили оба остатка одним и тем же красителем Cy5.Используя Cy3 в качестве донора, мы наблюдали два отдельных пика FRET на временных траекториях (Рис. S3 A ). Временной интервал между двумя пиками был удлинен, когда ATPγS был смешан с ATP (фиг. S3 B ), что указывает на то, что два пика представляют собой последовательное зондирование остатков Cys80 и Cys64.

Мы извлекли продолжительность взаимодействия акцепторных флуорофоров Cy3 и Cy5 с ClpXP (Δτ _Cy3 , Δτ _Cy5 ). Мы наблюдали положительные различия во времени пребывания (Δτ _Cy3-Cy5 = Δτ _Cy3 — Δτ _Cy5 , 〈Δτ _Cy3-Cy5 〉 = 3.5 с) для субстрата с маркировкой N-конца Cy3 и внутренней маркировкой Cy5 (рис.2 C , серый, _Cy3 NH ₃ -17-C _Cy5 -ssrA). Для подложки с замененными позициями красителя ( _Cy5 NH ₃ -17-C _Cy3 -ssrA) мы наблюдали отрицательные различия (рис.2 C , белый цвет, 〈Δτ _Cy3-Cy5 〉 = — 3,9 с). Таким образом, меченые красителем аминокислоты, расположенные ближе к С-концевой метке ssrA, удерживались в комплексе ClpXP в течение более коротких периодов времени, чем меченые аминокислоты, расположенные ближе к N-концу.Мы можем сделать вывод, что наш сканер отпечатков пальцев может обнаруживать красители в порядке, соответствующем аминокислотной последовательности. Упорядоченное исчезновение сигналов Cy3 и Cy5 дополнительно подразумевает, что нерасщепленный или частично расщепленный субстрат не накапливается в камере ClpP ₁₄ , что в противном случае затрудняло бы точное снятие отпечатков пальцев.

Производительность одномолекулярного дактилоскопического устройства.

Одномолекулярный дактилоскопический сканер должен работать без какого-либо отклонения от флуорофоров и с высоким динамическим диапазоном.Чтобы определить чувствительность нашего фингерпринтера, мы выполнили популяционное исследование, в котором ClpP ₁₄ был помечен донорным флуорофором (Alexa488), а субстратные пептиды были помечены отдельно либо Cy3, либо Cy5 в качестве акцепторного флуорофора (рис. 2 D и E ). Мы смешали Cy3- и Cy5-меченые субстраты в различных пропорциях (1:99, 10:90, 25:75, 50:50, 95: 5) и подсчитали количество событий транслокации. Мы наблюдали линейную зависимость между процентом обнаруженных нами субстратов, меченных Cy3, и ожидаемым значением со смещением 0.58 ± 0,79% и крутизной 0,98 ± 0,02 (скорректировано R ² = 0,99) (рис. 2 F ). Мы пришли к выводу, что обе пары FRET обнаруживаются с одинаковой чувствительностью и что наш сканер FRET может обнаруживать белки с низким содержанием.

Наш предыдущий вычислительный анализ показал, что точность нашего метода снятия отпечатков пальцев будет повышена, если можно дополнительно определить расстояние между мечеными остатками цистеина и лизина, а также их порядок (10).Равномерная скорость сканера, представленная ClpX ₆ , имеет решающее значение для извлечения информации о расстоянии. Чтобы определить, пропорционально ли время обработки ClpXP длине белковых субстратов, мы определили время обработки (время пребывания сигналов флуоресценции, испускаемых метками Cy5 на субстратах при прямом возбуждении) для трех пептидов [29, 40 и 51 длина аминокислот (аа)] (таблица S1), а также мономерная (119-аа) и димерная (210-аа) версии тайтина (все помечены как Cys) (таблица S1).График общего времени (∆τ) (рис. 3 A ), в течение которого субстрат был связан и обработан ClpXP, в зависимости от длины субстратов, показал линейное увеличение со средней скоростью обработки 23,9 а.о. в секунду (рис. B и рис. S4), что согласуется с предыдущими результатами, полученными как в массовом (28), так и в одномолекулярном анализе (11, 12, 29). Мы получили аналогичную скорость обработки 14,5 а.о. в секунду (транслокация 16 а.о. от меченого Cys64 к меченному Cys80 за 1,1 с) от дважды меченого тайтина (рис.S3 B ). На рис. 3 B смещение оси y на 4,2 с сообщает о начальной фазе стыковки и возможном удержании в пределах ClpP ₁₄ . Наши данные показывают, что фингерпринтер ClpXP может определять как порядок, так и расстояние между мечеными остатками.

ClpXP выполняет однонаправленное сканирование с постоянной скоростью. ( A ) Репрезентативный график времени. ROI (область интереса) — это место, где эффективность FRET постепенно увеличивается.∆τ: общее время стыковки. ( B ) Зависимость общего времени выдержки от длины субстрата. Среднее время 〈∆τ〉 было получено путем подгонки данных на рис. S4 с гамма-распределением. Использовали пять различных субстратов: K-16-C-ssrA ( n = 227), K-16-C-11-ssrA ( n = 131), K-16-C-22-ssrA ( n = 290), мономер тайтина ( n = 85) и димер тайтина ( n = 81). Длина субстрата — это количество аминокислот между С-концом и красителем, наиболее проксимальным к N-концу.Планки погрешностей, полученные бутстрэппингом с 1000 повторных выборок. Линейная подгонка дает смещение 4,0 ± 0,20 с и скорость 23,9 ± 2,86 а.о. в секунду. ( C ) График плотности перехода. Изменение FRET было проанализировано путем измерения FRET _{t = τ} и FRET _{t = τ + δτ} , с δτ = 0,4 с, для каждой точки ROI. Пунктирная линия представляет FRET _δτ = FRET _{τ + δτ} .Использовали K-38-C-ssrA ( n = 44). ( D и E ) Общее время пребывания (∆τ) для тайтина WT ( n = 124) и тайтина _V13P ( n = 114). Δτ = 7,5 ± 2,7 с и 7,3 ± 1,6 с были получены, соответственно, путем аппроксимации гамма-распределением. Ошибки, полученные при загрузке с 1000 повторных выборок. WT тайтин, n = 123. Титин _V13P , n = 112. ( F ) Количество трасс, показывающих события FRET для тайтина и тайтина WT _V13P .Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от 15 измерений.

Однонаправленная транслокация также имеет огромное значение для нашей технологии. Обратное отслеживание ClpXP приведет к ошибкам вставки в наблюдаемый отпечаток пальца и, таким образом, снизит точность обнаружения. Чтобы оценить возникновение обратного отслеживания, мы определили изменение FRET во времени во время обработки пептидных субстратов. Мы создали 2D тепловую карту, построив график изменения FRET за заданный интервал времени δτ. На рис. 3 C FRET (t = τ + δτ) в сравнении с FRET (t = τ) откладывается для каждой временной точки вдоль временной трассы, сообщающей о перемещении [Рис.3 A , регион интереса (ROI)]. Мы установили δτ = 0,4 с, временной масштаб больше, чем наше временное разрешение (0,2 с), но меньше, чем среднее время транслокации (0,7 с, рис. 1 D ), чтобы визуализировать постепенное увеличение FRET. Любой откат ClpX ₆ вдоль субстрата будет приводить к мгновенному снижению FRET во время транслокации, что проявляется как значения FRET (t = τ + δτ) ниже, чем FRET (t = τ) (популяция ниже диагонали). Мы наблюдали FRET (t = τ + δτ) выше, чем FRET (t = τ) (верхняя диагональная совокупность) для основной фракции (92.5%) точек данных. Оставшаяся часть, вероятно, связана с обратным отслеживанием ClpX, статистическим шумом сигналов флуоресценции и фотомиганием акцепторных красителей. Предполагается, что такая степень экспериментальной ошибки не повлияет на возможность извлечения информации о длине в соответствии с нашим расчетным моделированием (10).

Одномолекулярный белковый фингерпринтер должен быть способен обрабатывать любой структурный элемент белка. Исследования ClpXP с помощью одномолекулярной силовой спектроскопии показали, что ClpX ₆ останавливается на субстратах с жесткими вторичными структурами (30, 31), что может препятствовать извлечению информации о последовательности.Поэтому мы исследовали возможность разрушения таких плотно сложенных структур для снятия отпечатков пальцев. Было показано, что нарушение остатков цистеина в белке тайтина влияет на вторичную структуру белка, заставляя его вести себя как неструктурированная полипептидная цепь (32, 33). Мы очистили домен I27 как тайтина WT, который, как известно, заставляет ClpX ₆ stall (30), так и тайтина _V13P , варианта, который все еще свернут, но разлагается со скоростью, близкой к денатурированному тайтину (33).С помощью флуорофора, мечения цистеиновых остатков тайтина WT и тайтина _V13P , мы стремились определить степень структурного влияния конъюгации цистеин-краситель на процессинг ClpXP. Мы получили эквивалентные общие времена пребывания для обработки стабильного тайтина WT (Δτ = 7,5 ± 2,7 с, рис. 3 D ) и тайтина _V13P (Δτ = 7,3 ± 1,6 с, рис. 3 E ). Примерное количество обоих субстратов было обработано ClpXP в течение нашего временного интервала наблюдения (рис. 3 F ), что указывает на то, что ClpX ₆ может обрабатывать меченые субстраты WT и V13P с одинаковой эффективностью.Эти результаты предполагают, что подготовка субстратов для секвенирования путем мечения остатков цистеина (а также, вероятно, остатков лизина) может в достаточной степени дестабилизировать их белковые структуры. Это позволит снимать отпечатки пальцев с любого белка, независимо от его структурной стабильности.

Обсуждение

Мы продемонстрировали платформу обнаружения на основе FRET, использующую протеазу AAA + в качестве сканера пептидов и белков. В нашем подходе мы конъюгируем флуорофоры с тиоловыми группами остатков цистеина и аминогруппами N-концевого сайта (который может быть расширен до остатков лизина), потому что эти химические группы могут быть помечены с высокой эффективностью и специфичностью.Однако наша платформа не ограничивается этими двумя модификациями. При соответствующей химии можно было бы нацелить другие остатки или даже посттрансляционные модификации. Обнаружение этих группировок может быть реализовано путем расширения нашей нынешней трехцветной схемы FRET до четырехцветной FRET (21).

Остается несколько выдающихся перспектив для непосредственного применения нашего метода в технологии секвенирования белков. Во-первых, для протеомного анализа наша методика секвенирования должна работать для всех клеточных белков без систематической ошибки последовательности.ClpX, ядро ​​нашей платформы, распознает только подложки, отображающие определенные теги последовательности, включая ssrA. Субстратная селективность и специфичность ClpX необходимо расширить в равной степени для каждого субстрата, возможно, за счет целевых мутаций в петлях распознавания субстрата канала ClpX или использования сконструированных адаптерных белков (например, модифицированного SspB), которые неспецифически доставляют субстраты к ClpX. Во-вторых, задача анализа клеточных белков состоит в том, чтобы обнаружить белки с низким содержанием в сложном образце, таком как клинический образец ткани.Глубина охвата секвенированием может быть увеличена путем хроматографического удаления белков домашнего хозяйства (34). В-третьих, чтобы охватить весь протеом за разумное время, необходимо увеличить пропускную способность. В стандартных условиях, используемых в этой работе (10 нМ подложка, камера 512 × 512 пикселей, ClpX ₆ ), мы получили ~ 10 продуктивных реакций в минуту на область изображения. Используя дополнительную камеру на основе металл-оксид-полупроводник (CMOS), которая имеет большее количество пикселей (например,, 2084 × 2084 пикселей) (35), а также платформу с нулевым режимом волновода, которая позволяет получать изображения одной молекулы с более высокой концентрацией субстрата (например, 1 мкМ) (36), производительность может быть увеличена в раз ~ 1000. Мы также наблюдали, что продуктивные реакции (след, оканчивающийся высоким FRET) составляют только ~ 10% от общей популяции (рис. S2 D ). Мы подозреваем, что такой низкий выход связан с отсутствием в наших экспериментах адаптерных белков, которые способствуют связыванию, таких как sspB. Добавляя адаптерные белки и заменяя гексамерный связанный ClpXΔN на WT, мономерный ClpX, который содержит N-концевой домен, необходимый для связывания адаптерных белков, мы ожидаем, что процент продуктивной популяции достигнет почти 100%.Когда наш секвенсор будет улучшен этими изменениями, мы ожидаем покрыть 1 × одного протеома клетки человека (∼10 ⁸ белков) почти за 10 часов (10 событий в минуту × 16 × 100 × 10 ≈ 10 ⁷ событий в час). На практике будут возникать ошибки секвенирования, и однократное покрытие может оказаться недостаточным для точного определения отпечатка пальца белка. Однако количество копий клеточного белка обычно колеблется от 10 ⁰ до 10 ⁷ , что приводит к эффективному охвату 10 ⁰ –10 ⁷ × на вид белка.Для надежного охвата видов белка с наименьшей численностью потребуется увеличенное мультиплексирование сверх 1 ×, что может быть достигнуто за счет дальнейшего усовершенствования оборудования.

Наш метод позволяет сканировать полноразмерные белки от конца до конца без необходимости фрагментации. Субстраты для секвенирования обрабатываются с постоянной скоростью, что позволяет точно идентифицировать белок (10). В этом исследовании, подтверждающем концепцию, мы демонстрируем нашу способность обнаруживать низкочастотные субпопуляции субстратов с различной меткой, а также нашу способность последовательно обнаруживать различные акцепторные флуорофоры на одном субстрате.Платформа, которую мы представляем здесь, может превратить протеомику из инструмента фундаментальных исследований в бесценный актив клинической диагностики.

Методы

Конструкции, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице S1. Дополнительные методы можно найти в SI Methods .

Приготовление проб одиночных молекул.

Чтобы уменьшить неспецифическое связывание белков, кислые кварцевые слайды, травленные пираньями (G. Finkenbeiner), пассивировали двумя циклами полиэтиленгликоля [mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5000, Laysan, затем MS (PEG) ₄ , Piercenet], как описано ранее (37).После сборки микрожидкостной проточной камеры предметные стекла инкубировали с 5% Tween 20 в течение 10 минут (38), а избыток Tween 20 промывали буфером T50 (10 мМ Tris⋅HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl), а затем 1 раз. -мин инкубации со стрептавидином (0,1 мг / мл; Sigma). Несвязанный стрептавидин промывали 100 мкл буфера Т50, затем 100 мкл буфера PD (25 мМ Hepes, pH 8,0, 5 мМ MgCl ₂ , 40 мМ KCl, 0,148% Nonidet P-40, 10% глицерин). ClpX ₆ : ClpP ₁₄ = 1: 3 молярное соотношение использовали для обеспечения образования комплекса ClpXP с молярным соотношением 1: 1 (39).Затем 30 нМ ClpX ₆ и 90 нМ ClpP ₁₄ (WT или мутантный) предварительно инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре в присутствии 10 мМ АТФ в буфере для PD. После предварительной инкубации образец разбавляли в 10 раз буфером PD для достижения ожидаемой конечной концентрации комплекса ClpXP 3 нМ. Разбавленный образец наносили в проточную камеру и инкубировали в течение 1 мин. Несвязанные комплексы ClpXP промывали 100 мкл буфера для PD, содержащего 1 мМ АТФ. Затем в проточную камеру вводили 10-20 нМ меченого акцептором субстрата в присутствии буфера для визуализации (0.8% декстроза [Sigma], 1 мг / мл глюкозооксидазы [Sigma], 170 мг / мл каталазы [Merck] и 1 мМ тролокс [(±) -6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2 -карбоновая кислота, 238813] [Sigma]). Меченный донором ClpP ₁₄ , добавленный в камеру без ClpX ₆ , приводил к очень небольшому количеству неспецифически иммобилизованных белковых комплексов ClpP, исключая любую неспецифическую адсорбцию ClpP ₁₄ на поверхности (рис. S1 B ). Все эксперименты проводились при комнатной температуре (23 ± 2 ° C).

Флуоресценция одиночных молекул.

Измерения флуоресценции одиночных молекул выполнялись с помощью флуоресцентного микроскопа полного внутреннего отражения призменного типа. Для двухцветных измерений молекулы Cy3 возбуждали с помощью лазера с длиной волны 532 нм (Compass 215M-50; Coherent), а молекулы Cy5 возбуждали с помощью лазера с длиной волны 633 нм (25 LHP 928; CVI Melles Griot). Сигналы флуоресценции от отдельных молекул собирали через иммерсионный объектив с 60-кратным увеличением (UplanSApo; Olympus) с инвертированным микроскопом (IX71; Olympus). Рассеянный свет от лазерных лучей 532 нм и 633 нм блокировался тройным фильтром (NF01-488 / 532/635; Semrock).Сигналы Cy3 и Cy5 разделяли с помощью дихроичного зеркала (635 dcxr; Chroma) и отображали с помощью камеры EM-CCD (Andor iXon 897 Classic; Andor Technology).

Для трехцветных измерений молекулы Alexa488 возбуждали лазером с длиной волны 473 нм (OBIS 473 нм LX, 75 мВт; когерентный), молекулы Cy3 возбуждали с помощью лазера с длиной волны 532 нм (сапфировый 532 нм, 100 мВт; когерентный). , и молекулы Cy5 возбуждали лазером с длиной волны 637 нм (OBIS 637 нм LX, 140 мВт; Coherent). Сигналы флуоресценции от одиночных молекул собирали через иммерсионный объектив с 60-кратным увеличением (UplanSApo; Olympus) с инвертированным микроскопом (IX73; Olympus).Лазерный луч 473 нм блокировался длиннопроходным фильтром 473 нм (BLP01-473R-25; Semrock), лазерный луч 532 нм блокировался режекторным фильтром 532 нм (NF03-532E-25; Semrock), а лазерный луч с длиной волны 637 нм блокировался режекторным фильтром с длиной волны 633 нм (NF03-633E-25; Semrock). Сигналы Alexa488, Cy3 и Cy5 были разделены дихроичными зеркалами (540dcxr и 635 dcxr; Chroma) и отображены с помощью камеры EM-CCD (Andor iXon 897 Classic; Andor Technology).

Сбор данных.

Образцы возбуждались попеременно разными цветами и с использованием специальной программы, написанной на Visual C ++ (Microsoft).Записывалась серия изображений ПЗС с выдержкой 0,1 с. Временные кривые были извлечены из серии изображений CCD с использованием алгоритма IDL (ITT Visual Information Solution), который идентифицирует пятна флуоресценции с определенным гауссовым профилем и с сигналами, превышающими среднее значение фоновых сигналов. Совместная локализация сигналов Alexa488, Cy3 и Cy5 проводилась с помощью специального алгоритма сопоставления, написанного на IDL. Полученные временные трассы обрабатывались с помощью программ Matlab (MathWorks) и Origin (Origin Lab).

Благодарности

Мы благодарим Марека Нога, Иво Северинса и Анну Хаагсму за техническую поддержку; Стэнли Чандрадосс и Маргрит Доктер за создание многоцветной оптической системы; Луку Лёффу и Мише Кляйну за помощь в анализе данных; и Тиму Блоссеру, Лауре Рестрепо, Маргрит Доктер, Стефани Херема, Ноортье де Хаан и Виктории Глобайт за критическое прочтение рукописи. Экспрессионные плазмиды ClpX ₆ были щедрым подарком Андреаса Мартина. Плазмиды экспрессии ClpP были щедрым подарком от Тани Бейкер и Роберта Зауэра.Плазмиды экспрессии титина были щедрым подарком Виктора Муньоса и Йорга Шёнфельдера. C.J. и A.S.M. финансировались Фондом фундаментальных исследований материи (гранты Projectruimte 12PR3029 и Vrije Programma SMPS).

Сноски

• Вклад авторов: J.v.G., A.S.M. и C.J. разработали исследование; J.v.G., M.F., M.S. и P.T. проведенное исследование; J.v.G. и М.Ф. проанализированные данные; и J.v.G., M.S., A.S.M. и C.J. написали статью.

• Заявление о конфликте интересов: J.v.G., C.J. и A.S.M. имеет патент («Секвенирование единичных молекул белка»; WO2014014347).

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1707207115/-/DCSupplemental.

Модель хвостовика English, черное дерево, черный лад, скрипка 4/4, 115 мм | Насадки из черного дерева

Необходимые файлы cookie помогают сделать веб-сайт пригодным для использования, обеспечивая такие основные функции, как навигация по страницам и доступ к защищенным областям веб-сайта.Веб-сайт не может работать должным образом без этих файлов cookie.

ElioBack_buttonPressed
Цель: Маркер того, что посетитель нажал кнопку «Назад», и необходимо выполнить восстановление вкладки отображения.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ElioCouponManager_NoCodeModal
Назначение: Отображение промокодов для конкретных посетителей. Маркер того, что модальное окно должно оставаться закрытым.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ElioCurrencyConverter_ExchangeRates
Назначение: Предоставление коэффициентов пересчета для конвертера валют.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ElioCurrencyConverter_selectedCurrency
Назначение: Сохранение текущей выбранной валюты в конвертере валют.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ElioGlossar_
Цель: Предоставление статей глоссария.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ElioGroupSeries_variantClicked
Цель: Маркер для восстановления вкладки отображения при нажатии кнопки возврата.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ElioStorageClearedNew
Цель: Указывает, была ли произведена очистка локального хранилища.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ElioTabs_selectedTabs
Цель: Маркер для восстановления вкладки отображения при нажатии кнопки возврата.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

Функциональная проверка возможности записи локального / сеансового хранилища. Запись автоматически удаляется сразу после создания.

PayPal платежи

PayPal платежи

PayPal платежи

Запоминает, закрыл ли пользователь модальное окно выбора купона

Сессия —
Цель: Уникальный внутренний идентификатор пользователя магазина, который требуется для обеспечения основных функций магазина, таких как корзина для покупок и вход в систему.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

ShopwarePluginsCoreSelfHealingRedirect
Назначение: Технически необходимая функция для перенаправления страниц в случае ошибок загрузки страницы.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

__csrf_token-
Цель: Обеспечивает безопасность просмотра посетителями, предотвращая подделку межсайтовых запросов.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

allowCookie
Цель: Хранение настроек посетителя, разрешенных ли файлы cookie.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: 180 дней

BasketCount
Назначение: Хранение количества элементов в корзине.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

cookieDeclined
Цель: Сохранение настройки посетителя, запрещены ли файлы cookie в целом.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: 180 дней

cookiePreferences
Цель: Хранение настроек посетителей в Менеджере согласия на использование файлов cookie.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: 180 дней

eCurrentSuffix
Назначение: Устанавливается, когда запрашивается страница магазина с соответствующим параметром в URL-адресе и служит для предоставления соответствующей информации о ценах.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

eNote_notes
Цель: Хранение статей, содержащихся в списке желаний пользователя, для отображения кнопок списка желаний как активных.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ePrice
Цель: Хранение пользовательских настроек для отображения цены брутто или нетто.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: 365 дней

ePriceClose_tax-frame-shown
Назначение: Маркер того, отображался ли уже выбор цены брутто / нетто.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

ePush
Назначение: Хранение хеш-значения элементов, отправленных браузеру через HTTP2 push.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: 30 дней

ffSelectedPerPage
Назначение: Хранение настроек посетителя, сколько статей должно отображаться на странице с листингом.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

hide-cookie-permission
Цель: Маркер, следует ли скрывать разрешение cookie для определенного языка магазина.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

modernizr
Цель: Функциональная проверка возможности записи локального / сеансового хранилища. Запись автоматически удаляется сразу после создания.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

nocache
Назначение: Необходимый cookie для управления обработкой кеша.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

магазин
Назначение: Хранение идентификационного номера магазина на языке, запрошенном посетителем.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

testcookie
Цель: Функциональный тест для настроек файлов cookie.Этот файл cookie автоматически удаляется после создания.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

videojs_preferred_res
Цель: Маркер для предпочтительного или стандартного разрешения видео.
Провайдер: dictum.com
Тип: Локальное / сессионное хранилище

x-cache-context-hash
Назначение: Маркер для назначения цен для конкретного клиента после входа в систему.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

Партнер
Назначение: Устанавливается, когда страница магазина вызывается с соответствующим партнерским параметром в URL-адресе и используется для работы партнерской программы.
Провайдер: dictum.com
Тип: HTML
Срок действия: Сессия

Одномолекулярные FRET исследования котранскрипционного сворачивания тиаминпирофосфатного рибопереключателя

Значение

Молекулы РНК складываются в функциональные структуры по мере их синтеза путем транскрипции.Здесь мы разработали анализ резонансного переноса энергии флуоресценции одной молекулы (FRET), который позволяет в реальном времени контролировать котранскрипционную укладку молекул РНК. Этот одномолекулярный FRET-анализ позволяет проводить контролируемые исследования двух основных физических механизмов, которые регулируют котранскрипционную укладку РНК: паузу транскрипции и скорость транскрипции.

Abstract

Поскольку РНК сворачиваются в процессе синтеза, их скорость транскрипции может влиять на их укладку.Здесь мы сообщаем результаты исследований флуоресценции одиночных молекул, которые характеризуют лиганд-зависимую котранскрипционную укладку рибопереключателя Escherichia coli thiM , который регулирует трансляцию. Мы обнаружили, что аптамер рибопереключателя сворачивается в конформацию «выключено» независимо от своего лиганда, но переключается в конформацию «включено» во время паузы транскрипции рядом со стартовым кодоном трансляции. Связывание лиганда поддерживает рибопереключатель в выключенной конформации во время транскрипционных пауз.Мы ожидаем, что наш анализ позволит контролируемое исследование двух основных физических механизмов, которые регулируют котранскрипционное сворачивание: пауза транскрипции и скорость транскрипции.

Ключевой принцип биологии состоит в том, что структура определяет функцию. Функциональная РНК, работающая как регуляторы, рибозимы и каркасы в больших молекулярных комплексах, должна правильно складываться для правильного функционирования. Некоторые факторы, такие как соли, метаболиты и температура, могут влиять на укладку РНК, изменяя ее термодинамический энергетический ландшафт (1–3).Однако функциональные роли РНК могут быть временными (4). Это означает, что у РНК может не хватить времени, чтобы найти глобальный минимум ландшафта энергии сворачивания, прежде чем они начнут функционировать. In vivo РНК складываются последовательно от 5′-конца к 3′-концу по мере их синтеза. На их сворачивание также влияют транскрипционные паузы, которые встречаются повсеместно (5). Следовательно, возможно, что на функциональную структуру РНК может сильнее влиять кинетика транскрипции, чем глобальный энергетический ландшафт сворачивания РНК (6-9).

Производство тиамина в бактериях, грибах и растениях контролируется структурой РНК, называемой рибопереключателем тиаминпирофосфата (TPP) (10⇓⇓ – 13). Рибопереключатель TPP существует в нетранслируемых областях матричных РНК, где он регулирует их сплайсинг, транскрипцию или трансляцию, связывая связывание TPP со структурным переходом рибопереключателя (11). В качестве примера модель регуляции трансляции рибопереключателя Escherichia coli thiM показана на рис. 1 A (12, 14).В связанной с ТПФ форме ТФП инкапсулирован в аптамерную область, которая состоит из спиралей P1 – P5. В этом состоянии трансляция подавляется (состояние «выключено»), потому что сайт связывания рибосомы (RBS) недоступен для рибосом. В TPP-несвязанной форме пары оснований разорванной спирали P1 с последовательностью анти-RBS, и начинается трансляция (состояние «включено»).

Флуоресцентный анализ котранскрипционного сворачивания одиночных молекул. ( A ) Модель для индуцированного TPP структурного перехода E.coli ThiM рибопереключатель. Положения метки флуорофора для исследований одиночных молекул обозначены зелеными и красными прямоугольниками (зеленый для Cy3 или Dy547, красный для Dy647). ( B ) Схема эксперимента. РНК семян, меченную Dy647, инкубировали с цепью матричной ДНК и РНКП фага Т7 в пробирке в течение 50 мин при 37 ° C. Для сборки полной ЭК в пробирку добавляли Cy3-меченный UTP и неэлементную цепь ДНК и инкубировали в течение 20 мин. ЭК были иммобилизованы на пассивированной полимером кварцевой поверхности с использованием взаимодействий стрептавидин-биотин.Элонгацию возобновляли путем инъекции NTP, в то время как сворачивание РНК наблюдали с помощью микроскопа одномолекулярного FRET. ( C ) Флуоресцентные изображения одиночных молекул EC (, верх, ) и контрольные (ctrl) изображения неспецифически связанного Cy3-UTP (, нижний, ). Совместно локализованные пятна Cy3 и Cy5 обведены кружками. Процент акцепторных пятен, совместно локализованных с донорскими пятнами, оценивается как 57 ± 14% по 10 измерениям.

Как связывание TPP вызывает такой обширный структурный переход рибопереключателя? Рентгеновская кристаллическая структура аптамерной области рибопереключателя TPP показывает, как рибопереключатель распознает TPP с высокой лигандной специфичностью (12, 15), но механизм, связывающий связывание TPP со структурным переходом, остается неясным.Были использованы различные методы для характеристики как безлигандного состояния аптамера рибопереключателя TPP, так и его структурного перехода при связывании лиганда (14, 16–20). Исследование оптического улавливания показало, что аптамер образует вторичную структуру до связывания TPP и третичное взаимодействие после связывания TPP (17). Исследование резонансного переноса энергии флуоресценции одиночных молекул (FRET) показало, что TPP стабилизирует структуру стержня P1 (19). Несмотря на применение такого количества методов, механизмы, связывающие связывание TPP со структурными переходами рибопереключателя TPP, еще до конца не изучены.Чтобы понять регуляцию рибопереключателя TPP, необходимо визуализировать котранскрипционный фолдинг аптамера в контексте полного рибопереключателя (11, 21, 22).

Результаты

Одномолекулярный FRET-анализ для котранскрипционного сворачивания.

Для мониторинга котранскрипционного сворачивания TPP-рибопереключателя на уровне одной молекулы мы приготовили комплекс элонгации (EC), нагруженный дважды меченым РНК-транскриптом, как показано на рис. 1 B . Сначала мы инкубировали Cy5-меченную РНК семян с матричной ДНК (Таблица S1) и РНК-полимеразой фага Т7 (РНКП) в пробирке в течение 50 мин.Затем мы собрали полные ЭК, инкубируя тройные комплексы с нетемплатной ДНК и Cy3-меченным UTP. Затем мы иммобилизовали их на пассивированной полимером кварцевой поверхности, используя взаимодействия стрептавидин-биотин. Сравнение флуоресцентных изображений с ЭК и без них показывает низкий уровень неспецифического связывания и высокую эффективность сборки ЭК (рис. 1 C ). Чтобы возобновить удлинение, мы добавили NTP во время съемки флуоресцентных изображений одиночных молекул. В этой экспериментальной схеме транскрипция останавливается при встрече со стрептавидином на кварцевом предметном стекле, обеспечивая средства для контроля длины транскрипта РНК, участвующего в сворачивании, путем изменения длины ДНК-матриц.Позиции маркировки Cy3 и Cy5, использованные для экспериментов, показаны на рис. 1 A . Значение константы диссоциации ( K _d ) меченного красителем рибопереключателя было аналогично значению K _d для немеченого рибопереключателя TPP на основе измерений изотермической калориметрии (23, 24), что указывает на то, что маркировка красителем действительно существенно не мешает связыванию TPP. Мы также подтвердили, что высокий FRET возникает, когда TPP связывает рибопереключатель (24).

Котранскрипционное сворачивание аптамера TPP Riboswitch.

Сначала мы изучили котранскрипционную укладку области аптамера. Предыдущие структурные и биохимические исследования показали, что T7 RNAP инкапсулирует дуплекс ДНК длиной 21 п.н. и транскрипт РНК длиной от 11 до 14 нуклеотидов (25) (рис.2 A ), но мы не могли предсказать, сколько нуклеотидов транскрипта РНК будут выставлены вне RNAP, когда транскрипция остановится. Чтобы гарантировать, что у нас есть РНК-транскрипт, область аптамера которого полностью экспонируется при остановках транскрипции, мы приготовили серию ДНК-матриц с различной длиной ниже кодирующей области аптамера (D10 – D19 на рис.2 В ).

Котранскрипционное сворачивание аптамера. ( A ) Модель EC застряла на поверхности. Транскрипт РНК из 11–14 нуклеотидов и матрица ДНК из 21 нуклеотидов защищены ЭК. ( B ) Серия ДНК-матриц с различной длиной нисходящего потока (черный) после области аптамера (синий). Длина ДНК изменялась за счет прогрессивной делеции нижележащей части при сохранении оранжевой области. Матрицы ДНК названы D # в соответствии с их длиной в нисходящем направлении (#).( C ) Типичные временные характеристики эксперимента по котранскрипции одной молекулы с D17. Интенсивности флуоресценции донора и акцептора окрашены в зеленый и красный цвета соответственно, а соответствующий FRET — в черный цвет. Общая интенсивность (I _total ) показана оранжевым цветом. NTP (200 мкМ) и TPP (200 мкМ) вводили через 30 с и 100 с соответственно (пунктирные линии). ( D ) Гистограммы FRET до ( верх, ) и после ( низ ) введения 200 мкМ TPP для D17.( E ) Гистограммы FRET до ( верх, ) и после ( низ ) введения 200 мкМ TPP для термически отожженного синтетического аптамера. ( F ) Оценка правильно свернутой РНК для котранскрипционно свернутого D17 ( Left ) и термически отожженного аптамера ( Right ). Использовались два разных метода: подгонка гистограмм FRET в D , Bottom и E , Bottom к двум функциям Гаусса (синие столбцы) и подсчет молекул, чувствительных к TPP (красные столбцы).Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех экспериментов, каждый с более чем 50 молекулами. ( G ) Гистограмма FRET для D17 при концентрациях 10 мкМ NTP во время транскрипции. ( H ) Гистограмма FRET для D17 в присутствии 200 мкМ TPP во время транскрипции. В D , G и H концентрации TPP и NTP указывают значения, используемые во время фазы элонгации, но гистограммы были сделаны после введения 200 мкМ TPP. ( I ) Доля популяции D10 – D19 с высоким FRET.Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех экспериментов, каждый с более чем 50 молекулами.

На рис. 2 C показаны характерные временные кривые, полученные с помощью D17, который является достаточно длинным, чтобы полностью обнажить аптамерную область рибопереключателя при остановке, как показано на рис. 2 I . После инъекции NTP общая интенсивность падала одновременно со скачком FRET (рис. 2 C ). Известно, что интенсивность Cy3 увеличивается, когда белок расположен рядом (26), поэтому мы интерпретировали падение интенсивности Cy3 при инъекции NTP как уход Cy3-меченного основания из RNAP.После ожидания 70 с, чтобы РНК удлинялась к сайту остановки, мы добавляли 200 мкМ TPP, чтобы наблюдать эффекты связывания TPP. Мы наблюдали увеличение эффективности FRET после инъекции TPP, что указывает на успешное связывание TPP с рибопереключателем (рис. 2 C ). Сравнение гистограмм FRET до и после инъекции TPP показывает большое увеличение популяции с высоким FRET в присутствии TPP (рис. 2 D ). С другой стороны, когда мы провели тот же эксперимент с термически отожженным синтетическим аптамером, увеличение популяции с высоким FRET, вызванное ТФП, было намного меньше (рис.2 E ). Затем мы использовали два разных подхода для оценки относительной популяции правильно свернутых (т. Е. TPP-чувствительных) молекул. Мы подгоняли гистограммы FRET в присутствии TPP к двум гауссовым функциям (гистограммы на рис.2 D , Bottom и E , Bottom ) и подсчитали количество молекул со скачками FRET при введении TPP. (Рис.2 C ). Как показано на рис.2 F , оба подхода дали аналогичные результаты для котранскрипционно свернутого аптамера (75% vs.67%), но дает значительную разницу для термически отожженной РНК (40% против 12%). В случае термически отожженной РНК значительная часть молекул не реагировала на TPP, но вносила вклад в высокую популяцию FRET (рис. S1). Эти молекулы внесли свой вклад в оценку правильно свернутой РНК в подходе подгонки, но не в подходе подсчета. В случае котранскрипционно свернутой РНК молекулы в области с высоким FRET перед инъекцией TPP были очень динамичными и демонстрировали переход в стабильное состояние FRET с повышенным значением FRET (рис.2 С ). Это наблюдение указывает на то, что высокая популяция FRET термически отожженной РНК в присутствии TPP является гетерогенной и включает правильно свернутые РНК вместе со значительной долей неправильно свернутых РНК. Это наблюдение согласуется с точкой зрения о том, что энергетический ландшафт для длинных РНК довольно сложен (27, 28). С котранскрипционным сворачиванием, однако, возможно достичь более высоких уровней конформационной гомогенности, потому что именно последовательное сворачивание определяет путь сворачивания.

Затем мы использовали шаблон D17, чтобы изучить, как котранскрипционная складчатость зависит от различных условий удлинения. Когда мы замедлили скорость транскрипции, используя только 10 мкМ NTP вместо 200 мкМ, мы наблюдали сокращение популяции с высоким FRET с 75% до 70% (рис. 2 G ). Это снижение может быть небольшим, но статистически значимым (рис. S2). С другой стороны, присутствие TPP во время элонгации не влияет на популяции сворачивания (Fig. 2 H ), указывая на то, что аптамер сворачивается в неконформацию независимо от TPP.

Наконец, мы выполнили эксперимент на рис. 2 C с другими матрицами ДНК. Популяция с высоким FRET сильно зависела от длины ДНК-матрицы, расположенной ниже кодирующей области аптамера (фиг. 2 I и фиг. S3). Поскольку рибопереключатель TPP достигает полной аффинности связывания TPP только после завершения синтеза аптамера (24, 29), рис. 2 I позволяет нам точно определить длину транскрипта РНК, участвующего в сворачивании при остановке транскрипции.Изучая гистограммы FRET и кинетику связывания TPP, мы пришли к выводу, что область аптамера полностью экспонируется на матрицах D16-D19 (Fig. S4). В последующих обсуждениях каждый транскрипт РНК будет обозначаться как «R #», например, R144, где # относится к номеру положения последнего нуклеотида, экспонированного вне RNAP во время остановки транскрипции.

Котранскрипционное складывание полного рибопереключателя TPP.

Установив, что область аптамера сворачивается независимо от TPP, мы изучили котранскрипционную укладку полного рибопереключателя (R159).По сравнению с областью аптамера, высокая популяция FRET полного рибопереключателя упала с 75% до 61% (рис. 3 A , Top ), и это снижение было еще более заметным, когда мы снизили скорость транскрипции (рис. A , Средний ). Однако добавление 200 мкМ TPP во время транскрипции восстановило исходную популяцию с высоким FRET, которую мы наблюдали с одной только областью аптамера (фиг. 3 A , Bottom ). Способность TPP поддерживать высокую популяцию FRET зависела от концентрации TPP, при этом средняя точка приходилась на 30 мкМ (рис.3 B и рис. S5). Это почти в 300 раз выше, чем TPP K _d аптамера, который мы наблюдали in vitro (24, 30), но он аналогичен критической концентрации in vivo, которая регулирует продукцию тиамина (31, 32). Тот факт, что концентрация TPP, которая регулирует сворачивание рибопереключателя, намного больше, чем у рибопереключателя K _d , согласуется с гипотезой о том, что сворачивание рибопереключателя контролируется кинетически (22).

Котранскрипционное сворачивание полного рибопереключателя TPP.( A ) Гистограммы FRET R159 при трех различных условиях удлинения. Гистограммы FRET получали в присутствии 200 мкМ TPP. ( B ) Фракция популяции аптамера с высоким FRET (R89) и полного рибопереключателя (R159) с различными концентрациями TPP во время элонгации. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех экспериментов, каждый с более чем 50 молекулами. ( C ) Фракция популяции рибопереключателя с высоким FRET разной длины. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех экспериментов, каждый с более чем 50 молекулами.( D ) Репрезентативная временная диаграмма, которая показывает переход (синий треугольник) от выключенной конформации к включенной конформации для РНК R144. Интенсивности флуоресценции донора и акцептора окрашены в зеленый и красный цвета соответственно, а соответствующий FRET — в черный цвет. Общая интенсивность (I _total ) показана оранжевым цветом. NTP (200 мкМ) и TPP (200 мкМ) вводили через 30 с и 100 с соответственно (пунктирные линии). ( E ) Период полураспада в выключенном состоянии R144 и период транскрипционной паузы E.coli RNAP в области стартового кодона трансляции. ( F ) Фракция популяции мутантов рибопереключателя с высоким FRET. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех экспериментов, каждый с более чем 50 молекулами.

Влияние паузы транскрипции на сворачивание рибопереключателя TPP.

Данные на фиг. 3 A, и B ясно показывают, что на конечные продукты фолдинга полного рибопереключателя TPP влияет присутствие TPP во время транскрипции, а величина эффекта зависит от скорости транскрипции.Основываясь на этих наблюдениях, мы предположили, что если скорость транскрипции влияет на конечные продукты сворачивания рибопереключателя TPP, пауза транскрипции может иметь более значительный эффект на сворачивание рибопереключателя (33). Используя гель-анализ, мы обнаружили, что длинные паузы транскрипции в диапазоне десятков секунд возникают рядом с кодоном начала трансляции при транскрипции РНКП E.coli , но не РНКП фага Т7 (рис. S6). Сайты паузы, которые мы наблюдали с E. coli RNAP, согласуются с предыдущими сообщениями (33, 34).Чтобы имитировать эффект транскрипционной паузы, мы изучили сворачивание транскриптов разной длины. Мы наблюдали большой эффект TPP, когда RBS и стартовые кодоны трансляции экспонировались при остановке транскрипции (Fig. 3 C и Fig. S7), доказывая важность транскрипционной паузы в регуляции сворачивания. Временные кривые FRET одной молекулы R144 в отсутствие TPP показывают, что резкое уменьшение выключенной конформации связано с тем, что переход от выключенной конформации к включенной конформации происходит во время остановки (рис.3 D и рис. S8). Переход из состояния во включенное состояние происходил с периодом полужизни 3,9 с, что более чем в 10 раз меньше, чем период полужизни при транскрипционной паузе (фиг. 3 E и фиг. S9). Мы не наблюдали такого перехода в присутствии 200 мкМ TPP; включенное или выключенное состояние поддерживалось в течение 150 с времени наблюдения (рис. S10). Это неудивительно, поскольку время связывания TPP с рибопереключателем было измерено как 71 с (24).

Наконец, мы проверили влияние мутаций рибопереключателя на сворачивание R144.Рибопереключатель TPP имеет несколько сайтов, которые высоко консервативны у разных видов (23). Наша модель регуляции рибопереключателя TPP предсказывает, что последовательность области аптамера играет функциональную роль во время распознавания лиганда, тогда как последовательность платформы экспрессии играет роль во время структурного перехода от выключенного к включенному. Как и ожидалось, мы обнаружили функциональную дихотомию между аптамером и платформой экспрессии. Мутации в области аптамера (R144_P1 и R144_A69G) уменьшали популяцию в выключенном состоянии, указывая на соответствующее снижение связывания лиганда (рис.3 F и рис. S11). Тем не менее, мы наблюдали значительные регуляторные эффекты TPP у этих мутантов (фиг. 3 F и фиг. S11). Мутации в платформе экспрессии (R144_mRBS и R144_mAntiRBS), с другой стороны, привели к почти полному исчезновению регуляторных эффектов TPP, в то время как популяция вне состояния оставалась относительно неизменной (рис. 3 F и рис. S11). ).

Обсуждение

Наш анализ котранскрипционного сворачивания одиночных молекул дал следующие наблюдения.Во-первых, аптамер сворачивается в выключенную конформацию независимо от TPP (Fig. 2 H ), и TPP эффективно связывает аптамер только после того, как область аптамера полностью обнажена (Fig. 2 I ). Во-вторых, конформация выключения переключается на конформацию включения во время транскрипции из области аптамера в RBS (рис. 3 A ), и переход усиливается наличием транскрипционной паузы, которая возникает, когда RNAP приближается к кодону начала трансляции (рис. 3 C и D и рис.S8 и S9). В-третьих, переход от одного состояния к другому, который происходит во время транскрипции и транскрипционной паузы, ингибируется в присутствии TPP (фиг. 3 A и C и фиг. S10). Наконец, регуляторный эффект TPP в основном исчезает после транскрипции RBS (рис. 3 C ). Основываясь на этих наблюдениях, мы предлагаем механизм регуляции для рибопереключателя TPP (Рис. 4), который согласуется с мутационными исследованиями на Рис. 3 F . В этой модели TPP имеет короткое временное окно для регуляции трансляции, которое начинается с синтеза аптамера и заканчивается после транскрипции RBS.После того, как это окно прошло, переход между выключенным и включенным состояниями становится более трудным, эффективно блокируя способность TPP регулировать рибопереключатель.

Модель котранскрипционного сворачивания и регуляции рибопереключателя TPP.

Транскрипционная пауза возле стартового кодона трансляции — часто наблюдаемое явление (35, 36). В случае рибопереключателя TPP функциональная роль этой транскрипционной паузы очевидна. Изучив вторичные структуры рибопереключателя TPP, стало ясно, что, когда рибопереключатель удлинен и выставлен ниже стартового кодона трансляции, конформация включения становится более благоприятной, чем конформация выключения (ΔG0 = -40 vs.−30 ккал · моль − 1). Таким образом, паузы транскрипции в этом положении могут быть выбраны эволюцией, чтобы предоставить РНК достаточное время для переключения на конформацию включения.

В модели, показанной на рис. 1 A , TPP вызывает структурный переход рибопереключателя TPP из включенной конформации в выключенную. Наши данные, напротив, показывают, что рибопереключатель TPP сворачивается в конформацию выключения в отсутствие TPP, и что TPP работает как своего рода «английская булавка», которая препятствует структурному переходу из выключенного состояния во включенное состояние во время транскрипционной паузы. .Будет интересно посмотреть, насколько универсален этот механизм для других рибопереключателей.

Считается, что рибопереключатели, регулирующие терминацию транскрипции, контролируются кинетически, тогда как рибопереключатели, регулирующие инициацию трансляции, считаются термодинамически контролируемыми (22, 37). Наша работа ясно показывает, что рибопереключатель E. coli thiM , регулирующий инициацию трансляции, находится под кинетическим контролем. Это говорит о том, что механизмы кинетического контроля более распространены, чем ожидалось.Также очевидно, что сворачивание молекулы РНК должно контролироваться кинетически, если регулирование этой РНК должно осуществляться, как только РНК синтезируется. Даже возникающие РНК с промежутком времени между их синтезом и достижением функциональной регуляции могут не иметь достаточно времени, чтобы достичь точки термодинамического равновесия с точки зрения конформации, прежде чем они начнут функционировать. По мере удлинения РНК эта тенденция становится еще более очевидной. В этих случаях кинетический контроль сворачивания РНК имеет больше смысла.

В общем, энергетические ландшафты для сворачивания РНК довольно труднопроходимы. Следовательно, кинетика последовательного сворачивания и транскрипции может играть важную роль в сворачивании РНК. Мы успешно создали анализ FRET одной молекулы для изучения влияния котранскрипции на укладку РНК. По сравнению с анализами, основанными на оптическом захвате (17, 38), наш анализ FRET одной молекулы имеет несколько важных достоинств: он более эффективен, может различать различные конформации сворачивания и может сообщать о связывании / диссоциации лиганда без разворачивания РНК.

Полимеразы-хозяева также имеют значительное влияние на укладку РНК. Хотя влияние RNAP на укладку РНК в первую очередь объясняется приостановкой транскрипции, скорость транскрипции также является важным фактором. По сравнению с E. coli RNAP, T7 RNAP редко демонстрирует какие-либо паузы транскрипции. Наш анализ одномолекулярного FRET может использовать это отсутствие транскрипционной паузы с T7 RNAP. Мы можем воспользоваться отсутствием внутренних сайтов паузы, эффективно имитируя транскрипционную паузу, заставляя паузы в определенных положениях; наличие пауз сайтов, как у E.coli RNAP, затруднит контроль и изучение эффектов транскрипционной паузы. T7 RNAP транскрибируется быстрее, чем E. coli RNAP. Наш анализ также позволил нам изучить влияние скорости транскрипции, контролируя концентрацию NTP.

Таким образом, наш анализ может быть использован для изучения котранскрипционного сворачивания бактериальных или эукариотических РНК. Это позволяет нам проводить хорошо контролируемые исследования котранскрипционных эффектов двух основных физических механизмов: транскрипционной паузы и скорости.Хотя наш анализ предоставляет простые средства для непосредственного изучения физических механизмов котранскрипционного сворачивания, есть также несколько других факторов in vivo, которые влияют на скорость транскрипции, паузу транскрипции и конформационную перестройку РНК. Чтобы изучить эти факторы, необходимо разработать более сложные анализы котранскрипционного сворачивания.

Методы

Получение синтетического аптамера.

Подробные процедуры описаны в SI Методы .

Восстановление ЕС.

РНК семян (800 нМ) инкубировали в пробирке с цепью матричной ДНК (200 нМ) и РНКП Т7 (40 нМ; New England Biolabs) в течение 50 мин при 37 ° C. Меченый донором UTP (Cy3-UTP, 100 мкМ; GE Healthcare) и неэлементная цепь ДНК (400 нМ) добавляли в пробирку и инкубировали в течение 20 мин перед экспериментом с одной молекулой. Более подробные процедуры представлены в SI Methods .

Одномолекулярные эксперименты с FRET.

После покрытия стрептавидином (0,2 мг / мл; Invitrogen) кварцевых слайдов с полимерным покрытием (39) в течение 5 мин, ЭК (400 пМ) иммобилизовали на поверхности и визуализировали с помощью самодельного широкопольного флуоресцентного микроскопа полного внутреннего отражения. оснащен зеленым лазером (532 нм, Compass215M; Coherent) и красным лазером (640 нм, Cube640-100C; Coherent).Все эксперименты проводились при 37 ° C и времени экспозиции 50 мс в режиме переменного лазерного возбуждения (40, 41). Для удлинения транскрипции использовали различные концентрации NTP и TPP, но высокие фракции FRET для транскриптов РНК определяли в присутствии 200 мкМ TPP. Более подробная информация представлена ​​в SI Методы .

Анализ паузы, инициированной промотором, с использованием

Линейную матрицу ДНК (50 нМ), содержащую промотор T7A1, за которым следует рибопереключатель TPP, инкубировали с 50 нМ E.coli Холофермент РНКП в течение 10 мин при 37 ° C в буфере для транскрипции. Остановленные ЭК (+20) были сформированы добавлением 150 мкМ динуклеотида ApU (Trilink), 20 мкМ GTP и CTP, 1 мкМ АТФ и 10 мкКи [α- ³² P] АТФ (3000 Ки / ммоль). Затем транскрипции позволяли возобновиться путем добавления всех четырех NTP (50 мкМ) и гепарина (100 мкг / мл). Анализы транскрипции in vitro с использованием T7 RNAP выполнялись аналогичным образом. Более подробная информация представлена ​​в SI Методы .

Благодарности

Эта работа была поддержана программой Creative Research Initiative Program (грант 2009-0081562, S.H.) и Национальным исследовательским советом по науке и технологиям (грант DRC-14-2-KRISS, предоставленный C.K.).

Сноски

• Автор: H.U. и С. спланированное исследование; H.U., W.K. и K.S.H. проведенное исследование; H.U., W.K. и K.S.H. проанализированные данные; и H.U., W.K., K.S.H., C.K. и S.H. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1712983115/-/DCSupplemental.

Framus Fret Jet 5/115/52 Candy Orange 1960-х годов — Reforged Guitars

€ 670

Информация о моделях Framus Thinline:
Первая гитара Framus thinline была разработана в 1953 году в сотрудничестве с Билли Лоренто, также известным как Билл Лоуренс. Это была не только первая фирменная модель из Франконии, но и первая электрогитара с тонким резонирующим корпусом, установленным грифом и без блока сустейна внутри, что очень характерно для гитар, произведенных Framus.В этом сегменте последовали модели Hi-Fi-Six и, конечно же, такие классические модели, как New Sound и Fret Jet.

Производство гитар началось в 1954 году с открытия фабрики Bubenreuth и быстро превратилось в производство с промышленными характеристиками. Широкое использование массивной древесины стало более редким, поэтому для производства использовались частично твердые материалы или использовалось только ламинированное производство. Всего до начала семидесятых было выпущено более 40 различных моделей тонких и полуакустических инструментов; одна из последних — это снова гитара с именем Билли Лоренто и с номером модели 07301.

Источник: framus-vintage.de/modules/modells/modells.php?classID=2,3,7&typeID=19-24,33,34,49,50,53-56,169,170&katID=4627&cl=EN

Информация об этой гитаре:
Когда я впервые увидел этот Framus, я был восхищен изумительным цветом Candy Orange и знал, что она снова засияет, если я просто дам ей немного любви. У гитары отшлифованный гриф, новые лады и новый бридж, и звучит она потрясающе. Результатом очень доволен 🙂

Гитара после полной проверки и настройки профессиональным мастером, готова к игре!

Состояние :

• Головка — состояние очень хорошее, крышка анкера отсутствует.
• Ключи — новых ключей Grover! Старые (оригинальный Framus) будут добавлены в комплект.
• Гайка — отличное состояние.
• Гриф — отличное состояние.
• Гриф — в очень хорошем состоянии с двумя видимыми следами использования на первом и втором ладу. Гриф был отшлифован профессиональным мастером в сочетании с рефретированием.
• Лады — новинка от профессионального мастера.
• Кузов — очень хорошее состояние с небольшими неровностями и царапинами (все видно на фото).
• Лак — хорошее состояние мелкие неровности и царапины и трещинки от лака по бокам (все видно на фото).
• Электроника — состояние отличное — после полной проверки мастером.
• Оснащение — звукосниматели значительно поцарапаны, но без влияния на играбельность, царапины на накладке и отсутствие одного угла.
• Дополнения — оригинальные ключи Framus, новые ключи Grover, новые струны, новый бридж.

Нет в наличии

Addgene: pJSC115 — бактериальная экспрессионная плазмида для SpCas9-HF1, вариант HNH FRET

Эти плазмиды созданы вашими коллегами.Пожалуйста, примите во внимание Главный исследователь, процитируйте статью, в которой были описаны плазмиды: и включите Addgene в Материалы и методы ваших будущих публикаций.

• Для вашего Материалы и методы раздел:

  pJSC115 — бактериальная экспрессионная плазмида для SpCas9-HF1, вариант HNH FRET был подарком от Дженнифер Дудна и Кейт Джунг (Плазмида Addgene # 101210; http: // n2t.сеть / addgene: 101210; RRID: Addgene_101210)

• Для вашего Ссылки раздел:

  Улучшенная корректура определяет точность таргетинга CRISPR-Cas9 .Chen JS, Dagdas YS, Kleinstiver BP, Welch MM, Sousa AA, Harrington LB, Sternberg SH, Joung JK, Yildiz A, Doudna JA. Природа. 2017 20 сентября. Doi: 10.1038 / nature24268. 10.1038 / природа24268 PubMed 28931002

Активность ГТФаз семейства Rho во время деления клеток, визуализированная с помощью зондов на основе FRET | Журнал клеточной биологии

кДНК RBD эффекторных белков, включая mDia1 человека (аминокислотные остатки 1–176), мышиный Rhotekin (аминокислотные остатки 1–88), мышиный Rhophilin (аминокислотные остатки 37–107), человеческий PKN (аминокислотные остатки 13–98) и кДНК белка. Rac1 / Cdc42-связывающий домен PAK (а.о. 68–150) амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами, несущими сайты узнавания рестрикционного фермента на их 5′-конце, и субклонировали в pCR ^® -Blunt II-TOPO ^® (Invitrogen).Плазмиды для мониторов RhoA были сконструированы с использованием по существу той же процедуры, что была использована для конструирования pRaichu-Ras (Mochizuki et al., 2001). От аминоконца Raichu – RhoA – 1202, –1208, –1125, –1126, –1206 и –1212 состояли из YFP (aa 1–228), спейсера (Leu-Asp), дикого типа или мутантов человеческий RhoA (аминокислотные остатки 1–189), спейсер (Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr), RBD эффекторных белков, спейсер (Gly-Gly-Arg) и CFP (аминокислотные остатки 1–237). Raichu-1110X, -1111X, -1214X, -1220X, -1104X, -1105X, -1218X и -1224X состояли из YFP (aa 1–228), спейсера (Leu-Asp), RBD эффекторных белков, a спейсер (Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr), человеческий RhoA (aa 1–189), спейсер (Gly-Gly-Arg), CFP (aa 1–237), спейсер (Ser-Arg), и карбоксиконцевую область Ki-Ras4B (аминокислотные остатки 169–188).Raichu – RhoA – 1237X, –1238X и –1239X состояли из YFP (а.о. 1–228), спейсера (Leu-Asp), RBD PKN, спейсера (Thr-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly- Gly-Gly-Gly-Thr), RhoA дикого типа или мутанты RhoA человека (aa 1–189), спейсер (Gly-Gly-Arg), CFP (aa 1–237), спейсер (Gly-Arg-Ser -Arg) и CAAX-бокс Ki-Ras4B (а.о. 169–188; рис. 1 A). В Raichu-RhoA / RhoA-CT карбоксиконцевая область RhoA (а.о. 173–193) была заменена на Ki-Ras4B в Raichu-RhoA-1237X.

Эффекторные белки, используемые в каждом зонде, перечислены в таблице I.В Raichu – RhoA – 1239X, Asn был заменен на Thr ¹⁹ RhoA. В других пробах RhoA был либо диким типом, либо мутантом Gln ⁶³ Leu (Q63L), как указано в таблице I. В этой статье, если не указано иное, мы использовали модифицированный YFP [Thr ⁶⁶ Gly, Val ⁶⁹ Leu, Ser ⁷³ Ala, Met ¹⁵⁴ Thr, Val ¹⁶⁴ Ala, Ser ¹⁷⁶ Gly и Thr ²⁰⁴ Tyr] и CFP [Lys ²⁷ Arg, Tyr ⁶⁷ Trp, Asp ¹³⁰ Gly, Asn ¹⁴⁷ Iso, Met ¹⁵⁴ Thr, Val ¹⁶⁴ Ala, Asn ¹⁶⁵ His, Ser ¹⁷⁶ Gly] в качестве акцептора и донора соответственно.