Инфинити ку икс 50 тест драйв видео: Видео тест-драйвы Infiniti QX50 2021 — смотреть бесплатно

Дифференциальная экспрессия IFNB1 в поздние моменты времени (от 11 до 15 часов после инфицирования), когда происходило образование MNGC (рис. 1 C ), предполагает, что индукция экспрессии гена IFN типа I может зависеть от события клеточного слияние клеток. Количественная оценка MNGC приведена в Приложении SI , Таблица S1.Чтобы изучить эту возможность, мы использовали двойной мутант ∆bimA∆motA2 , который проявляет фенотип замедленного слияния клеток (10). BimA влияет на полимеризацию актина, а MotA2 влияет на внутриклеточную подвижность, оба из которых не являются частью T6SS5 и, следовательно, не должны иметь дефектную функцию T6SS5. Заражение мутантом ∆bimA∆motA2 при MOI 10 в течение 12 часов в макрофагах RAW264.7 не индуцировало образование MNGC и не увеличивало экспрессию гена IFNB1 , тогда как бактериальная инфекция дикого типа формировала MNGC и активировала IFNB1 ( SI Приложение , рис.S1 B и C ). И это несмотря на то, что у двух из них была сопоставимая бактериальная нагрузка ( SI, приложение , рис. S1 D ). В этих условиях ∆bimA∆motA2 экспрессировал гены T6SS5 hcp5 , vgrG5 и virA на уровнях выше B. thailandensis (приложение SI , рис. S1 E E ). В совокупности они представляют возможность того, что слияние клеток может запускать экспрессию гена IFN типа I.

Бактериальное слияние клеток индуцирует экспрессию гена IFN типа I независимо от бактериальных лигандов.

Некоторые VgrGs, которые формируют верхушку аппарата T6SS5, считаются «развитыми» и имеют расширенный карбоксиконцевой домен (CTD), который обеспечивает эффекторные функции. CTD Burkholderia VgrG5, как было показано, обладает фузогенной активностью, ответственной за слияние клеток с клетками и образование MNGC, и отделен от роли VgrG в секреции T6SS (12). Как и ожидалось, в RAW264.7 клеток, инфицированных vgrG5-∆CTD , MNGC не образовывались (фиг. 2 A и SI, приложение , таблица S1). Дефектный по слиянию мутант vgrG5-∆CTD также показал соответственно пониженную экспрессию гена IFNB1 по сравнению с клетками, инфицированными B. thailandensis (рис. 2 B ), что позволяет предположить, что слияние клеток с клетками индуцирует повышающую регуляцию экспрессия гена IFN типа I. Однако неясно, обнаруживает ли мутант vgrG5 — ∆CTD дефектное связывание эффекторов на кончике VgrG, поскольку VgrG может действовать как специфические адаптеры для доставки эффекторов (36, 37).Таким образом, когда мы инфицировали редко засеянные клетки бактериями дикого типа так, чтобы они не сливались (рис. 2 C ), экспрессия гена IFN типа I не индуцировалась, даже несмотря на то, что T6SS5 был активирован (рис. 2 D ). и E ). Это исключает роль любых потенциальных бактериальных эффекторов, связанных с CTD VgrG5, в индукции гена IFNB1 .

Бактериальное слияние клеток индуцирует экспрессию гена IFN I типа независимо от бактериальных лигандов. ( A ) Световые микрофотографии окрашенного по Гимзе RAW264.7 макрофагов, инфицированных B. thailandensis дикого типа, и дефектных по слиянию клеток vgrG5-∆CTD . Клетки, инфицированные ∆clpV5 , были включены в качестве контроля. Клетки инфицировали при MOI 10 и фиксировали для окрашивания и визуализации образования MNGC при 10-кратном увеличении объектива через 15 ч после заражения. (Масштабные полосы, 100 мкм.) ( B ) Экспрессия IFNB1 в макрофагах RAW264.7, инфицированных различными штаммами B. thailandensis , включая дисфункциональный слияние vgrG5-∆CTD .Макрофаги RAW264.7 были инфицированы при MOI 10 в течение 15 часов. Анализ был выполнен в трех повторностях, и значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. ( C ) Световые микрофотографии редко засеянных макрофагов RAW264.7, инфицированных B. thailandensis дикого типа и дефектных по слиянию клеток vgrG5-∆CTD . Клетки инфицировали при MOI 10 и фиксировали для окрашивания по Гимзе и визуализации образования MNGC при 10-кратном увеличении объектива через 15 ч после инфицирования. (Масштабные линейки, 100 мкм.) ( D ) Экспрессия IFNB1 в редко засеянных макрофагах RAW264.7, инфицированных B. thailandensis и vgrG5-∆CTD . Макрофаги RAW264.7 были инфицированы при MOI 10 в течение 15 часов. Уровни транскрипта IFNB1 измеряли с помощью qRT-PCR и нормализовали для неинфицированных клеток. GAPDH Ген использовали в качестве контроля гена домашнего хозяйства. Анализ был выполнен в трех повторностях, и значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. ( E ) Экспрессия бактериального гена T6SS5 hcp5 в редко засеянном RAW264.7 клеток инфицированы B. thailandensis . Уровни транскрипта hcp5 измеряли с помощью qRT-PCR и нормализовали до уровня через 2 часа после инфицирования. Анализ проводили в трех экземплярах, и значения выражали как среднее ± стандартное отклонение. ( F ) Световые микрофотографии окрашенных по Гимзе клеток HepG2, обработанных PEG-6000. Клетки HepG2 обрабатывали PEG-6000 и оставляли на 21 час для слияния клеток. Клетки, обработанные D-PBS, были включены в качестве контроля. Клетки окрашивали и визуализировали при 10-кратном увеличении объектива.(Масштабная шкала, 100 мкм.) ( G ) Экспрессия IFNB1 в клетках, обработанных PEG-6000. Клетки HepG2 обрабатывали ПЭГ-6000 и позволяли слиться в течение 21 часа. Транскрипты собирали и анализировали с помощью qRT-PCR. Уровни экспрессии генов были нормализованы для контрольных клеток, обработанных D-PBS. Анализ проводили в трех экземплярах, и значения выражали как среднее ± стандартное отклонение. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001; n.s., не имеет значения.

Чтобы еще раз подтвердить, что слияние клеток стимулирует экспрессию гена IFN типа I независимо от бактериальных лигандов, мы заменили бактериальную инфекцию полиэтиленгликолем (PEG), чтобы вызвать слияние клеток, чтобы не было помех со стороны бактериальных нуклеиновых кислот.Мы обнаружили, что слияние клеток, индуцированное PEG-6000, коррелировало с повышенной экспрессией гена IFN типа I как в эпителиальных клетках печени HepG2 (рис. 2 F и G и SI, приложение , таблица S1), так и в первичных мезенхимальных стволовых клетках человека. (hMSCs) ( SI Приложение , рис. S1 F и G и таблица S1). Эти данные подтверждают мнение о том, что слияние клеток является движущей силой экспрессии гена IFN I типа.

Активация пути cGAS – STING во время слияния клеток.

Индукция экспрессии гена IFN типа I может быть вызвана активацией PRR, включая Toll-подобные рецепторы и другие цитозольные рецепторы, чувствительные к нуклеиновым кислотам (38). Поскольку экспрессия T6SS5 и образование MNGC происходит после выхода бактерий из эндосомы в цитозоль (8), цитозольные PRR могут участвовать в повышающей регуляции экспрессии гена IFN типа I во время клеточно-клеточного слияния. STING воспринимает циклические динуклеотиды и, как сообщается, участвует в индукции IFN типа I посредством восприятия событий нарушения мембраны, таких как слияние вирусных клеток (39, 40).Нокаутные по STING макрофаги RAW, инфицированные бактериями дикого типа, не проявляли повышающей регуляции экспрессии гена IFNB1 по сравнению с инфицированными макрофагами дикого типа, хотя межклеточное слияние было обширным (рис. 3 A и B ). Поскольку STING также функционирует как адаптер для сенсоров цитозольной ДНК, мы оценили участие независимого от последовательности сенсора цитозольной ДНК cGAS, который функционирует выше STING. Инфекция B. thailandensis в макрофагах и соответствующих им клетках с нокаутом cGAS привела к обширному образованию MNGC, тогда как инфекция ∆clpV5 привела к меньшему образованию MNGC, а ∆vgrG5 был полностью дефектным в межклеточном слиянии (рис.3 С ). Значительная повышающая регуляция экспрессии гена IFNB1 наблюдалась только в B. thailandensis инфицированных клетках дикого типа, но не в B. thailandensis инфицированных cGAS клетках (фиг. 3 D ).

cGAS и STING необходимы для индукции слияния клеток экспрессии гена IFN типа I. ( A ) Световые микрофотографии окрашенных по Гимзе RAW-Lucia-ISG дикого типа и нокаутных по STING клеток, инфицированных различными штаммами B. thailandensis .Клетки инфицировали при MOI 10 и фиксировали для окрашивания и визуализации образования MNGC при 10-кратном увеличении объектива через 15 ч после инфицирования. (Масштаб, 100 мкм.) ( B ) Экспрессия IFNB1 в RAW-Lucia-ISG дикого типа и нокаутированных по STING клетках, инфицированных B. thailandensis и различными мутантами T6SS5. Клетки инфицировали штаммами B. thailandensis при MOI 10 в течение 15 часов. Анализ проводили в трех экземплярах, и значения выражали как среднее ± стандартное отклонение.( C ) Световые микрофотографии окрашенных по Гимзе RAW-Lucia-ISG дикого типа и клеток с нокаутом cGAS, инфицированных различными штаммами B. thailandensis . Клетки инфицировали при MOI 10 и фиксировали для окрашивания и визуализации образования MNGC при 10-кратном увеличении объектива через 15 ч после инфицирования. (Масштабная шкала, 100 мкм.) ( D ) Экспрессия IFNB1 в RAW-Lucia-ISG дикого типа и клетках с нокаутом cGAS, инфицированных B. thailandensis и различными мутантами T6SS5.Клетки инфицировали штаммами B. thailandensis при MOI 10 в течение 15 часов. Анализ проводили в трех экземплярах, и значения выражали как среднее ± стандартное отклонение. Примечание: ∆vgrG5 ^(a) — инсерционный мутант, а ∆vgrG5 ^(b) — делеционный мутант в рамке считывания. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001; n.s., не имеет значения.

Мы также использовали модель инфекции эпителиальных клеток предстательной железы TRAMP C2 с соответствующими нокаутными клетками STING, чтобы определить участие STING.Инфекция B. thailandensis в клетках дикого типа и клетках с нокаутом по STING привела к образованию MNGC, но не к T6SS5 ∆vgrG5 -инфицированным клеткам ( SI Приложение , фиг. S2, A и таблица S1). ∆clpV5 инфицированные мутантом клетки дикого типа и клетки с нокаутом STING также образовывали MNGC, но в меньшей степени по сравнению с клетками, инфицированными B. thailandensis ( SI Приложение , фиг. S2 A и таблица S1). Это ожидается, поскольку известно, что ClpV несущественен для начальной сборки и функции T6SS, но необходим для разборки и рециклинга субъединиц оболочки T6SS после сокращения, тем самым демонстрируя промежуточный фенотип (24, 27, 41).Степень клеточно-клеточного слияния соответствовала усилению экспрессии гена IFNB1 в инфицированных TRAMP C2 клетках дикого типа ( SI, приложение , рис. S2 B ). B. thailandensis- инфицированные клетки с нокаутом STING не имели значительной повышающей регуляции экспрессии гена IFNB1 , несмотря на формирование MNGC ( SI, приложение , фиг. S2). Таким образом, cGAS и STING стимулируются после образования MNGC и необходимы для зависимой от клеточно-клеточного слияния экспрессии гена IFNB1 .

Аберрантное деление клеток и реакция на повреждение ДНК после образования MNGC.

Чтобы лучше понять факторы, которые способствуют активации cGAS при слиянии клеток, мы использовали покадровую микроскопию для визуализации слияния клеток во время инфицирования B. thailandensis клеток HepG2. Мы выбрали клетки HepG2, поскольку их больший размер облегчает визуализацию. Степень межклеточного слияния в инфицированных клетках HepG2 соответствовала повышающей регуляции экспрессии гена IFNB1 ( SI Приложение , рис.S3 A и B и Таблица S1). Бактерии имели хромосомную вставку гена mApple, кодирующего красную флуоресценцию, тогда как периферия и ядра клеток были маркированы CellMask и Hoechst 33342 соответственно. Через 14 часов после инфицирования мы наблюдали огромный MNGC, содержащий высококонденсированный генетический материал, некоторые из которых напоминали митотические хромосомы (рис. 4 A , оранжевые звездочки и Movie S1). В отличие от обычного митоза, когда митотические хромосомы притягиваются к полюсам клетки, генетическое содержимое в MNGC перетасовывается без какого-либо направления.К 15 часам 30 минутам после инфицирования генетическое содержимое MNGC стало менее конденсированным, и на мембране наблюдались три точки сжатия (рис. 4 A , белые стрелки). Однако сужения мембраны рассасывались к 16 ч 15 мин и не приводили к образованию дочерних клеток. Эти наблюдения предполагают, что MNGCs подвергались абортивному клеточному делению. Дефектный митоз способствует повреждению ДНК (42), что, как сообщается, приводит к индукции IFN типа I по пути cGAS – STING (43⇓⇓ – 46).Таким образом, мы оценили показатели реакции на повреждение ДНК, которые активируются в ответ на повреждение ДНК. Моноубиквитинирование h3AX, индуцированное при двухцепочечных разрывах ДНК, инициирует передачу сигналов о повреждении ДНК за счет привлечения мутировавшей атаксии-телеангиэктазии (ATM). ATM, в свою очередь, фосфорилирует h3AX с образованием γ-h3AX, биомаркера повреждения ДНК (47). Более высокие уровни моноубиквитинированного h3AX и γ-h3AX были обнаружены в клетках, инфицированных B. thailandensis , по сравнению с клетками, инфицированными дефектным слиянием vgrG5-∆CTD (рис.4 B и SI Приложение , рис. S3 C ). Моноубиквитинированный γ-h3AX, биомаркер двухцепочечных разрывов, был более распространен в клетках, инфицированных B. thailandensis , чем в инфицированных клетках vgrG5-∆CTD– (рис. 4 B и SI, приложение , рис. S3 C ), предполагая, что двухцепочечные разрывы являются основной формой повреждения ДНК в слитых клетках. Мы также обрабатывали клетки MitoQ, ингибитором митохондриального стресса, чтобы определить, могут ли митохондрии быть источником повреждения и утечки ДНК, чтобы вызвать экспрессию гена IFNB1 , но не обнаружили различий из-за лечения ( SI Приложение , рис.S3 D ). Вместе эти данные демонстрируют, что слияние клетки с клеткой запускает активацию cGAS и последующую экспрессию гена IFN типа I через повреждение ДНК.

Burkholderia -индуцированные MNGCs обладают повышенной геномной нестабильностью, которая может быть обнаружена cGAS. ( A ) Конфокальные микрофотографии B. thailandensis tssA :: mApple -инфицированных клеток HepG2 с 13 ч 45 мин до 17 ч 30 мин после инфицирования. Периферия и ядра клеток помечены CellMask и Hoechst, представлены пурпурным и синим цветом соответственно.Бактерии представлены красным цветом. Оранжевые звездочки указывают на митотические хромосомы, белые стрелки указывают на точки сужения. Желтые стрелки обозначают рассеяние мембранного сужения. (Масштабная шкала, 20 мкм.) ( B ) Экспрессия маркеров повреждения ДНК в слитых клетках. Клетки TRAMP C2 инфицировали опытным слиянием клеток B. thailandensis и дефектным по слиянию vgrG5-∆CTD при MOI 10. Общие лизаты собирали через 18 часов после инфицирования. Белки разделяли на 4-15% геле SDS и анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителами против γ-h3AX и h3AX.Вестерн-блоттинг против β-актина был включен в качестве контроля. ( C ) Влияние клеточно-клеточного слияния, индуцированного инфекцией B. thailandensis , на геномную нестабильность. Клетки HepG2 были инфицированы штаммами B. thailandensis при MOI 50. Слитые клетки HepG2, инфицированные B. thailandensis , и неслитые клетки, инфицированные vgrG5-∆CTD , исследовали на наличие образования микроядер через 19 ч после инфицирования. Возникновение микроядер определяли количественно как количество микроядер на каждое исследованное ядро ​​и выражали как среднее значение из трех биологических повторов ± стандартное отклонение.Неинфицированные клетки были включены в качестве контроля. * P ≤ 0,05. ( D — F ) Конфокальные микрофотографии B. thailandensis tssA :: mApple инфицированных клеток HepG2 для визуализации микроядер. ( D ) Клетки инфицировали B. thailandensis tssA :: mApple с MOI 50: 1. Инфицированные клетки фиксировали через 19 часов после инфицирования для мечения ядер клетки-хозяина, ядерного ламина B1 и периферии клетки. B. thailandensis экспрессируют флуоресцентный белок mApple.Клетки визуализировали под конфокальным микроскопом при увеличении 63 ×. Ядра показаны синим цветом, ядерный ламин B1 — зеленым, периферия клеток — пурпурным, а бактерии — красным. Представленное наложенное составное изображение было автоматически сгенерировано программным обеспечением ZEN после получения изображения при сканировании плитки 5 × 5. Зона MNGC выделена белой линией. (Масштабная шкала, 100 мкм.) ( E ) Области, обозначенные желтыми прямоугольниками в D , были увеличены для визуализации микроядер.Белые стрелки указывают на разрыв микроядер. Желтые звездочки указывают на отсутствие совместной локализации между агрегатами ДНК с ядерным ламином B1. ( F ) Области, обозначенные красным прямоугольником на первых панелях E , были дополнительно увеличены для более четкой визуализации микроядер. Белые стрелки указывают на разрыв микроядер. Отсутствие совместной локализации между агрегатами ДНК с ядерным ламином B1 отмечено желтыми звездочками. ( G и H ) Локализация cGAS в клетках HepG2, инфицированных B.thailandensis и дефектный по слиянию клеток vgrG5-∆CTD . Клетки HepG2 инфицировали при MOI 50 и фиксировали через 19 ч после инфицирования для иммуноокрашивания cGAS, которые показаны зеленым. Ядра и периферию клеток были помечены с помощью Hoechst и CellMask, представленные синим и пурпурным цветом соответственно. Белые стрелки указывают на совместную локализацию cGAS и микроядер. Колокализация между агрегатами ДНК с cGAS отмечена желтыми звездочками. ( G ) Клетки визуализировали при увеличении 63 ×.(Масштабная шкала, 50 мкм.) ( H ) Области совместной локализации cGAS с микроядрами или агрегатами ДНК были увеличены из других полей зрения B. thailandensis инфицированных клеток HepG2. (Масштабная шкала, 20 мкм.)

Слияние клеток приводит к образованию микроядер.

Отличительным признаком повреждения ДНК и абортивного деления клеток является нестабильность генома и образование микроядер (48⇓ – 50). Мы исследовали возникновение микроядер, окрашивая B. thailandensis -инфицированные клетки HepG2 с помощью окрашивания ядерной ДНК Hoechst 33342.Поскольку сообщалось, что cGAS связывает микроядерную ДНК при разрыве и коллапсе ядерной оболочки (28), мы также пометили инфицированные клетки маркером ядерной оболочки, ядерным ламином B1, для оценки целостности ядерной оболочки. Наблюдалось значительное увеличение количества микроядер в B. thailandensis-, инфицированных MNGC, по сравнению с неслитыми vgrG5-∆CTD -инфицированными или -неинфицированными клетками (рис. 4 C — F ), что указывает на усиление геномная нестабильность в слитых клетках, вероятно, связана с митотическими ошибками.Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител к ламину B1 показал, что часть микроядер была разорвана, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания ламина B1 (фиг. 4 E и F ). Интересно, что мы также наблюдали большие агрегаты ДНК внутри MNGCs, которые не были окружены ядерной оболочкой (Fig. 4 E и F ). Поскольку cGAS может получить доступ к генетическому материалу внутри микроядер во время разрыва ядерной мембраны, отсутствие компартментализации крупных агрегатов ДНК в цитозоле может способствовать связыванию cGAS.Действительно, мы наблюдали, что cGAS колокализуется с частью микроядер, а также с крупными агрегатами ДНК в инфицированных B. thailandensis- клетках, которые формируют MNGC (рис. 4 G и H ). Мы также наблюдали совместную локализацию cGAS с микроядрами и обнаружили увеличение встречаемости микроядер в слитых клетках, опосредованных PEG-6000, по сравнению с неслитыми клетками ( SI Приложение , рис. S3 E — G ). Вместе эти данные указывают на то, что неестественное слияние клеток приводит к нестабильности генома и образованию микроядер.

Активация cGAS – STING приводит к гибели клеток, но не к продукции IFN типа I.

Сообщалось, что активация cGAS – STING приводит к различным способам гибели клеток (51 (– 55). Таким образом, мы исследовали возможность гибели клеток в слитых клетках, индуцированных бактериями. Клетки с нокаутом RAW cGAS и STING, инфицированные B. thailandensis , имели значительно меньшую гибель клеток по сравнению с клетками дикого типа, инфицированными B. thailandensis (фиг. 5 A и B ).Это также наблюдалось в клетках TRAMP C2, где B. thailandensis -инфицированные STING клетки имели более низкую цитотоксичность по сравнению с B. thailandensis -инфицированными клетками дикого типа ( SI Приложение , рис. S4 A ). Здесь повторное инфицирование клеток-хозяев было предотвращено добавлением антибиотиков в среду. Более высокие уровни цитотоксичности соответствовали более низкой внутриклеточной бактериальной нагрузке, что указывало на высвобождение бактерий в среду во время гибели клеток ( SI Приложение , рис.S4 B и C ). Чтобы исследовать, зависит ли наблюдаемая индукция цитотоксичности от передачи сигналов, опосредованной IFN I типа, мы исследовали количество IFN-β, продуцируемое инфицированными клетками. Клетки, инфицированные B. thailandensis дикого типа и штаммами с дефектом слияния ∆clpV5 и ∆bimA∆motA2 , продуцировали аналогичные низкие концентрации IFN-β (рис. 5 C ), которые не коррелировали с дифференциальная экспрессия генов, наблюдаемая между инфицированными клетками дикого типа и мутантными клетками.Уровни транскриптов IFN регуляторного фактора 7 (IRF7), которые опосредуют продукцию IFN типа I и активируются во время передачи сигналов IFN типа I, также были одинаковыми между клетками, инфицированными B. thailandensis и vgrG5-∆CTD , несмотря на различие Экспрессия гена IFNB1 (фиг. 5 D ). Эти данные показывают, что слияние клеток индуцирует экспрессию гена IFN типа I, но не приводит к продукции или передаче сигналов нижестоящего белка. Блокирование рецептора IFN1 типа I IFNAR1 во время инфекции не влияло на цитотоксичность (рис.5 E ) и внутриклеточные бактериальные нагрузки ( SI Приложение , рис. S4 D ). Эти данные показывают, что слияние клеток с клетками вызывает гибель клеток посредством передачи сигналов cGAS – STING независимо от IFN типа I.

Активизация cGAS и STING, запускаемая слиянием клеток, приводит к усилению цитотоксичности независимо от передачи сигналов IFN I типа. ( A и B ) Влияние клеточно-клеточного слияния на цитотоксичность и ее зависимость от пути cGAS – STING. ( A ) Макрофаги дикого типа RAW-Lucia-ISG и макрофаги с нокаутом cGAS были инфицированы B.thailandensis и дефектные по слиянию клеток vgrG5-∆CTD при MOI 10. Клетки оценивали на цитотоксичность с помощью анализа ЛДГ через 18 часов после инфицирования. ( B ) RAW-Lucia-ISG дикого типа и макрофаги с нокаутом по STING были инфицированы B. thailandensis и дефектным по слиянию клеток vgrG5-∆CTD при MOI 10. Клетки оценивали на цитотоксичность с помощью анализа LDH при 17 ч после заражения. Анализы проводили в трех повторностях, и значения выражали как среднее ± стандартное отклонение.( C ) Продукция IFN-β макрофагами RAW264.7, инфицированными B. thailandensis и различными мутантами T6SS5. Клетки инфицировали при MOI 10 и оценивали продукцию IFN-β с помощью ELISA через 24 часа после инфицирования. Анализ проводили в трех повторностях, и значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. ( D ) Эффекты индукции гена IFNB1 на нижестоящую экспрессию гена IRF7 в макрофагах RAW264.7, инфицированных B. thailandensis и дефектными по слиянию vgrG5-∆CTD .Клетки инфицировали при MOI 10: 1 и подвергали блокаде передачи сигналов IFN типа I через 8 часов после инфицирования с использованием антител, блокирующих рецептор IFNAR1. В эксперимент были включены контроли, обработанные изотипом. Транскрипты собирали через 18 ч после заражения. Уровни транскриптов IFNB1 и IRF7 измеряли с помощью qRT-PCR и нормализовали для неинфицированных клеток при каждой обработке с использованием метода порогового цикла (2 ^{— ΔΔ} Ct) с β-актином в качестве контрольного гена. Анализ проводили в трех экземплярах, и значения выражали как среднее ± стандартное отклонение.( E ) Влияние передачи сигналов IFN типа I на цитотоксичность в макрофагах RAW264.7, инфицированных B. thailandensis и дефектных по слиянию клеток vgrG5-∆CTD . Клетки инфицировали при MOI 10: 1 и подвергали блокаде передачи сигналов IFN типа I через 8 часов после инфицирования с использованием антител, блокирующих рецептор IFNAR1. В эксперимент были включены контроли, обработанные изотипом. Клетки оценивали на гибель клеток с помощью анализа ЛДГ через 18 часов после инфицирования. Анализ проводили в трех повторностях, и значения выражены как среднее ± стандартное отклонение.* P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001; n.s., не имеет значения; нет данных не обнаружен.

cGAS – STING-зависимая гибель аутофагических клеток.

Путь cGAS – STING, как было показано, важен для гибели аутофагических клеток во время репликативного кризиса, чтобы ограничить геномную нестабильность (51). Также было обнаружено, что домен STING, ответственный за активацию TBK и IRF3, ведущую к экспрессии IFN типа I, отделен от области, ответственной за индукцию аутофагии (55).Следовательно, мы исследовали возможность того, что слияние клетки-клетки запускает цитотоксичность через cGAS-STING-зависимую аутофагию. Превращение LC3-I в LC3-II путем конъюгации фосфатидилэтаноламина считается надежной мерой образования аутофагосом и, следовательно, указывает на активацию аутофагии (56). Мы обнаружили, что клеток B. thailandensis показали более высокие уровни соотношений LC3A-II / LC3A-I, чем неинфицированные или vgrG5-∆CTD -инфицированные клетки (рис. 6 A ).Нокаутные по STING клетки, инфицированные B. thailandensis , не показали более высоких соотношений LC3A-II / LC3AI по сравнению с клетками дикого типа (фиг.6, A ), что коррелирует с гораздо более низкой цитотоксичностью у cGAS и STING нокаутных клеток (фиг. 5 A и B и SI Приложение , рис. S4 A ). Кроме того, слияние клеток, индуцированное ПЭГ, привело к усилению цитотоксичности, что соответствовало увеличению отношения липидированного LC3B-II к LC3B-I ( SI Приложение , рис.S4 E и F ).

Слияние клеток с клетками приводит к зависимой от cGAS – STING аутофагической гибели клеток. ( A ) Индукция аутофагии в клетках TRAMP C2, инфицированных B. thailandensis и vgrG5-∆CTD . Чтобы исследовать индукцию аутофагии через путь STING, TRAMP C2 и соответствующие ему клетки STING KO были инфицированы способным к слиянию клеткам B. thailandensis и дефектным слиянием клеток vgrG5-∆CTD при MOI 10.Общие лизаты собирали через 22 часа после инфицирования. Белки разделяли на 4-15% геле SDS и анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителами против LC3A. Вестерн-блоттинг против β-актина был включен в качестве контроля. Интенсивность полос оценивали для трех биологических повторов с помощью денситометрического анализа и представляли как среднее отношение LC3AII / LC3AI или средние условные единицы (AU) ± SD. ( B ) Влияние аутофагии на цитотоксичность в клетках HepG2, инфицированных B. thailandensis и дефектными по слиянию vgrG5-∆CTD .Клетки HepG2 трансфицировали скремблированной РНК NC-1 или миРНК ATG-7 для нокдауна ATG-7. Трансфицированные клетки инфицировали при MOI 50: 1. Клетки оценивали на цитотоксичность с помощью анализа ЛДГ через 24 часа после инфицирования. Анализ был выполнен с тремя биологическими повторностями, и значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. ( C ) Световые микрофотографии скремблированной РНК NC-1 или трансфицированных миРНК ATG-7 клеток HepG2, инфицированных B. thailandensis . Клетки инфицировали при MOI 50 и фиксировали для окрашивания по Гимзе и визуализации образования MNGC через 24 часа после инфицирования.(Шкала 100 мкм.) * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001; n.s., не имеет значения.

Чтобы проверить, приводит ли индукция аутофагии во время слияния клеток к гибели клеток, мы выполнили нокдаун малой интерферирующей РНК (миРНК) важного гена аутофагии, ATG-7, и подвергли клетки инфекции B. thailandensis . Нокдаун ATG-7 привел к значительному снижению цитотоксичности во время инфекции B. thailandensis по сравнению с контролем, трансфицированным скремблированной РНК (рис.6 В ). Трансфекция скремблированной РНК или ATG-7 не влияла на образование MNGC во время инфицирования B. thailandensis (фиг. 6 C ). Ингибирование аутофагии бафиломицином A1 в B. thailandensis -инфицированных клетках дикого типа также привело к снижению цитотоксичности по сравнению с клетками, обработанными ДМСО отрицательным контролем, что указывает на то, что аутофагия вносит вклад в зависимую от слияния гибель клеток ( SI Приложение , Рис. S4 G ). Эти данные подтверждают, что аутофагическая гибель клеток происходит во время слияния клеток.

Мыши cGAS KO показали слегка замедленную смерть от инфекции в более низкой дозе.

Мы оценили выживаемость мышей с нокаутом cGAS после острой и хронической инфекции. Во время острой инфекции не наблюдалось различий в смертности между мышами дикого типа и мышами с нокаутом cGAS ( SI, приложение , рис. S5). Напротив, мыши с нокаутом cGAS явно выживали дольше во время более хронической инфекции, хотя статистический анализ с помощью теста Гехана-Бреслоу-Уилкоксона ( P = 0,4471) показал, что различия не являются значимыми.Наши результаты показывают, что путь cGAS – STING может парадоксальным образом способствовать усилению бактериального патогенеза, возможно, ускоряя гибель клеток и распространение бактерий за счет высвобождения внутриклеточных бактерий только при низкой дозе инфекции, и даже в этом сценарии это явно не тот вариант. заболевание, контролирующее основной путь.

Обсуждение

B. pseudomallei — факультативный внутриклеточный патоген, ответственный за мелиоидоз, который, по оценкам, убивает 89 000 человек во всем мире в год (1).После того, как бактерии вышли из эндосомных компартментов в цитозоль, B. pseudomallei запускает слияние инфицированных клеток с соседними клетками (10). Индукция клеточно-клеточного слияния Burkholderia традиционно рассматривается как стратегия, подобная троянскому коню, позволяющая бактериям скрыться от иммунного обнаружения, позволяя при этом локализованное распространение бактерий во время хронической инфекции (6). Вопреки этой общепринятой парадигме, мы обнаружили, что MNGC, индуцированные Burkholderia , не являются неподвижными делами, которые остаются незамеченными.Фактически они запускают активацию пути cGAS – STING, воспринимающего ДНК хозяина, что приводит к гибели аутофагических клеток. Активация пути cGAS – STING с помощью MNGCs происходит через повреждение ДНК и образование микроядер. Наше открытие молекулярных механизмов, относящихся к индуцированному Burkholderia слиянию клеток, также распространяется на химически индуцированное слияние клеток, а также на различные типы клеток, включая первичные hMSCs, демонстрируя, что это потенциально общий механизм, запускаемый существенным слиянием клетки-клетки.

До нашей работы нарушение мембраны, вызванное слиянием липосом и оболочечных вирусных клеток, считалось опасным сигналом, ведущим к активации STING (39, 40). Однако механизм активации STING этими видами мембранных нарушений не определен. Мы обнаружили, что слитые клетки имеют повреждение ДНК и повышенную геномную нестабильность, которые в последние годы обнаруживаются с помощью cGAS – STING (28, 43, 48–51, 55, 57, 58). Наши наблюдения, что MNGC подвергаются абортивному клеточному делению (рис.4 A и Movie S1) показывает, что повреждение ДНК вводится, когда происходит слияние клетки-клетки между несинхронизированными клетками. Поскольку слияние липосом и слияние оболочечных вирусов и клеток не образуют гетерокарионов, приводя к нарушению регуляции клеточного цикла, маловероятно, чтобы эти режимы мембранных нарушений запускали STING посредством одного и того же механизма. В то время как многоядерные клетки в гранулемах в Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (бацилла Кальметта-Герена) и Mycobacterium tuberculosis на животных моделях также были описаны как укрывающие двухцепочечные разрывы, образование MNGCs было вызвано недостаточностью эндо-цитокинезии. не клеточно-клеточное слияние (59).Здесь важно отметить решающее отличие: микобактерии не обладают присущей им способностью к слиянию клеток, в то время как Burkholderia обладают. Остается исследовать, могут ли такие поликарионы запускать сходную активацию cGAS-STING и их последующие ответы.

Ранее были сообщения о химически индуцированных слитых клетках или вирус-индуцированных синцитиях с геномными изменениями, включая разрывы ДНК и хромосомную нестабильность (60–62). MNGC у пациентов с мелиоидозом человека также обнаруживали аномальный генетический материал, включая диффузный хроматин и ядра, которые выглядели полилобатными с неровными краями (16), аналогично тому, что мы наблюдали в нашем B.thailandensis in vitro, модель инфекции HepG2. Литература 1960-х и 1970-х годов сообщала о преждевременной конденсации и измельчении хромосом в асинхронно слитых клетках (63⇓ – 65), событиях, в которых возможно повреждение ДНК. Накопление повреждений ДНК и нестабильность генома увеличивает шансы злокачественной трансформации. Фактически, события слияния клеток были предложены для облегчения приобретения злокачественных свойств. Это подтверждается сообщениями о том, что потомство слитых клеток обладает повышенной метастатической способностью и более канцерогенными (66⇓⇓⇓⇓ – 71).

С другой стороны, можно утверждать, что слияния клеток вносят вклад в естественную защиту от злокачественных новообразований посредством активации cGAS – STNG. Становится все более очевидным, что раковые клетки, подвергающиеся остановке клеточного цикла или репликативному кризису, несут повреждения ДНК и различные хромосомные аномалии и нестабильность, которые могут привести к гибели клеток. Сообщалось, что запуск IFN типа I по пути cGAS – STING запускает опухолевый иммунитет (43, 57, 72⇓⇓⇓⇓⇓ – 78). Также недавно было описано, что трансформированные клетки подвергаются аутофагической гибели посредством пути cGAS-STING посредством механизма, отличного от индукции IFN типа I (55).Отражая это открытие, мы продемонстрировали, что слияние клеток с клетками также приводит к активации аутофагии и соответствующей гибели клеток посредством пути cGAS – STING, независимо от IFN типа I. Обширная геномная нестабильность, вероятно, останавливает синтез белка, поскольку клетки подвергаются аутофагической гибели. Таким образом, возможно, что индуцированные Burkholderia слияния клеток увеличивают риск злокачественной трансформации клеток посредством предложенного нами механизма и функции пути cGAS-STING, чтобы ограничить этот процесс.Следовательно, дефекты пути cGAS-STING могут потенциально предрасполагать хозяина к развитию рака в обстоятельствах, когда происходят неестественные слияния клетки-клетки, включая индуцированные вирусом слияния клетки-клетки, такие как те, которые опосредованы ВИЧ.

B. pseudomallei и B. thailandensis являются сапрофитами окружающей среды и случайными патогенами человека. В чем может заключаться эволюционное преимущество поддержания энергозатратной системы секреции, объединяющей клетки млекопитающих? Естественная среда обитания бактерии в почве может подвергнуть ее воздействию одноклеточных организмов, таких как амебы, живущие в колонии, которые напоминают многоклеточный организм.T3SS3 и T6SS5 Burkholderia могли развиться с адаптацией, чтобы избежать амебной защиты. Способность объединить колонию одноклеточных амеб с образованием многоядерной гигантской амебы, по-видимому, является умным решением для увеличения радиуса инфицирования и прямого доступа к цитозольным компартментам без многократных циклов выхода и входа через фагосомы. Хотя путь cGAS-STING в основном участвует в ответах IFN типа I у позвоночных, C-концевой хвост STING, критический для рекрутирования компонентов передачи сигналов IFN типа I TBK1 и IRF3, отсутствует у беспозвоночных (79, 80).Поэтому постулируется, что индукция IFN типа I является относительно недавно появившейся функцией передачи сигналов cGAS – STING (79). Считается, что предковой функцией STING является индукция аутофагии, поскольку STING от примитивного беспозвоночного, морского анемона, как было показано, вызывает гибель аутофагических клеток, но не продукцию IFN типа I (55). Многоклеточные млекопитающие-хозяева развили путь cGAS-STING для борьбы с вторжениями цитозольной ДНК, будь то из-за геномной нестабильности или чужеродной ДНК для индукции IFN типа I, но также сохранили инициацию аутофагической гибели клеток при катастрофических обстоятельствах.Учитывая, что Burkholderia не эволюционировала и не адаптировалась для встречи с млекопитающими-хозяевами, последующая смерть клетки-хозяина, вызванная cGAS-STING, и исход, возможно, не адаптировались ни к преимуществу бактерий, ни к преимуществу хозяина. Это также может объяснить относительно слабый эффект в патогенезе инфицированных мышей с нокаутом cGAS по сравнению с мышами дикого типа.

Таким образом, мы обнаружили случай образования микроядер, запускающих патоген, посредством индукции слияния клеток-хозяев, тем самым активируя путь cGAS – STING и последующую гибель клеток ( SI Приложение , рис.S6). Мы предполагаем, что во время инфекции или фузогенного химического воздействия слияние клеток с клетками является опасным сигналом, воспринимаемым сенсорами врожденного иммунитета хозяина cGAS и STING. Тело, вероятно, демонстрирует дифференцированный ответ; меньшие вторжения патогенов в цитозоль приводят к эффективному иммунному ответу IFN типа I и аутофагии, которые могут служить для удаления цитозольных патогенов при активации cGAS. Однако обширное слияние клеток является катастрофическим событием, приводящим к аберрантному и прерванному митозу, что приводит к повреждению ДНК и геномной нестабильности.Это, в свою очередь, вызывает аутофагическую гибель клеток вместо продуктивного ответа IFN типа I с конечной целью ограничения клеточной трансформации. Еще предстоит выяснить, проявляют ли пациенты с хроническим мелиоидозом повышенную предрасположенность к раку, и если да, то есть ли у этих пациентов мутации в путях cGAS-STING или аутофагии, которые ослабят естественную защиту организма от нежелательных слияний клеток.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и конструирование мутантов.

Все бактериальные штаммы, использованные в этом исследовании, перечислены в Приложении SI , Таблица S2. Бактериальные штаммы обычно поддерживали на агаре с бульоном для лизогени (LB). Мутанты были получены из штамма E264 методом аллельного обмена. Плазмиды и праймеры, использованные для создания мутантов, перечислены в SI, приложении , таблицах S2 и S3, соответственно. Подробная информация о конструкции мутанта приведена в Приложении SI .

Клеточная инфекция и лечение.

См. SI Приложение для получения более подробной информации о культуре клеток и обслуживании.

Поскольку уровни экспрессии T6SS5 выше при выращивании бактерий в RPMI1640 (Gibco) по сравнению с DMEM, среду перед заражением заменили на RPMI, содержащую 10% FBS. Клетки инфицировали стационарными ночными культурами штаммов Burkholderia при указанных MOI и центрифугировали при 250 × g в течение 5 мин при комнатной температуре. Через 1-2 часа заражения добавляли канамицин (Sigma) для уничтожения внеклеточных бактерий при конечных концентрациях 250 мкг / мл и 300 мкг / мл для B.pseudomallei и B. thailandensis соответственно. Для инфекций с участием клеток HepG2 бактерии опсонизировали 50% сывороткой крови человека (Sigma) перед инфицированием в течение 1 ч при 37 ° C со встряхиванием.

Для оценки эффекта ответа IFN типа I в поздней фазе клетки обрабатывали антителом, блокирующим рецептор IFNAR1, 10 мкг / мл (eBioscience, 16-5945-85) или его соответствующим изотипическим контролем (eBioscience, 16-4714). −82) через 8 ч после заражения.

Для химически индуцированных слияний клетки-клетки клетки инкубировали с 50% (вес / объем) PEG-6000 или D-PBS в качестве отрицательного контроля в течение 2 минут при 37 ° C, 5% CO ₂ .После обработки клетки трижды промывали питательной средой для удаления остаточного PEG-6000.

Нокдаун ATG-7 в клетках HepG2.

Клетки HepG2 одновременно высевали и трансфицировали 30 нМ миРНК ATG-7 (hs.Ri.ATG7.13.1, Integrated DNA Technologies) или скремблированной РНК (NC-1 DsiRNA, Integrated DNA Technologies). Через 3 дня трансфицированные клетки обрабатывали трипсином для повторного посева и ретрансфекции 30 нМ миРНК ATG-7 или скремблированной РНК NC-1. Через 3 дня клетки использовали для B.thailandensis при указанной MOI.

Анализ экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени.

Тотальную РНК выделяли с использованием PureZOL (Bio-Rad) и illustra RNAspin Mini Kit (GE Healthcare). кДНК синтезировали с использованием набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Транскрипты были количественно определены с использованием iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) в системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX Connect (Bio-Rad). Праймеры для ПЦР перечислены в SI Приложение , Таблица S4. Для генов-хозяев относительные уровни РНК конкретного гена были нормализованы к D-PBS-обработанным или неинфицированным контролям с использованием метода порогового цикла (2 ^-ΔΔ Ct) с β-актином в качестве контрольного гена.Ген домашнего хозяйства GADPH использовали в качестве внутреннего контроля. Для бактериальных генов относительные уровни РНК генов в мутантных штаммах были нормализованы к дикому типу с использованием метода 2 ^-ΔΔ Ct с 16S в качестве контрольного гена. rpoB использовали в качестве внутреннего контроля.

Окрашивание по Гимзе для просмотра MNGC.

Клетки фиксировали 100% метанолом (Fischer Scientific) в течение 2 минут, один раз промывали дистиллированной водой и окрашивали 20-кратно разбавленным красителем Гимза (Sigma) в течение 15 минут.После окрашивания клетки один раз промывали дистиллированной водой и сушили на воздухе. Окрашенные клетки исследовали с помощью световых микроскопов (Olympus Model CKX53 или IX51) и изображения получали с помощью камеры для микроскопа Lumenera InfinityX и программного обеспечения Infinity Capture при увеличении объектива 10 ×.

Анализ цитотоксичности.

Цитотоксичность клеток измеряли путем анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в супернатантах клеток с использованием набора для анализа ЛДГ (Clontech).

Конфокальная визуализация в реальном времени.

Клетки HepG2 инфицировали флуоресцентным mApple B. thailandensis с MOI 50. Канамицин добавляли до конечной концентрации 300 мкг / мл через 1 час после заражения. Перед визуализацией среду заменяли на RPMI, содержащую 10% FBS, 10 мкг / мл Hoechst 33342 и 0,1 мкл / мл CellMask Deep Red Plasma для окрашивания мембран. Клетки визуализировали с помощью LSM710 (Zeiss) при увеличении 63 × от 13 ч 45 мин до 17 ч 30 мин после инфицирования с интервалами 15 мин.

Иммунофлуоресценция.

Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде (Sigma) в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем клетки пермеабилизировали 0,25% (об. / Об.) Тритоном-X в течение 10 минут при комнатной температуре и блокировали окрашивающим буфером, 5% FBS, 2% BSA (HyClone) и 0,1% (об. / Об.) Тритоном-X ( Merck) в 1 × PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Для визуализации ядерной оболочки клетки окрашивали кроличьим антителом против ламина B1 (ab16048, Abcam) в течение ночи при 4 ° C и затем окрашивали вторичным антителом Alexa Fluor 488 против кроличьего антитела (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 2 часов.Для локализации cGAS в микроядрах клетки окрашивали кроличьим антителом против cGAS (D1D3G, Cell Signaling Technologies) в течение ночи при 4 ° C, а затем антителом против кролика Alexa Fluor 555 (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем клетки окрашивали 10 мкг / мл Hoechst 33342 (ThermoScientific) и разбавленным 1: 10 000 красителем для мембран CellMask Deep Red Plasma (Invitrogen). Между каждым этапом инкубации клетки промывали 0,1% Triton-X (Merck). Покровные стекла помещали на чистые предметные стекла с помощью ProLong Gold Antifade (Invitrogen) и отображали на конфокальном микроскопе Zeiss LSM710 с использованием линзы объектива 63x.

Количественная оценка микроядер.

Конфокальные микрофотографии слитых клеток оценивали на наличие микроядер. Были исследованы только MNGC, содержащие более пяти ядер. Неинфицированные или обработанные D-PBS клетки были включены в качестве отрицательного контроля. Микроядра подсчитывались вручную в соответствии со следующими критериями: 1) микроядра меньше одной трети размера ядра, но достаточно велики, чтобы различать форму и цвет; 2) микроядра имеют округлую форму; 3) микроядра расположены внутри клеточной границы, что определяется окрашиванием клеточной маски; 4) граница микроядер отличается от границы ядра.Общее количество оцененных ядер было пересчитано для нормализации по условиям. В каждом состоянии было исследовано не менее 150 ядер. Появление микроядер представлено как количество микроядер на каждое исследованное ядро. Локализацию cGAS в микроядрах определяли визуально по полному наложению сигналов cGAS на микроядра.

ELISA.

Супернатанты культур получали для определения продукции IFN-β с помощью ELISA с использованием набора LEGEND MAX (Biolegend) в соответствии с инструкциями производителя в трех экземплярах.

Иммуноблоттинг.

Клетки лизировали в 0,5% (об. / Об.) Triton-X с добавлением 1х смеси ингибиторов протеазной фосфатазы (Thermo Scientific). Лизаты центрифугировали при 6,500 × г в течение 10 мин при 4 ° C. Фракции супернатанта кипятили в 1 × SDS-буфере laemmli (Bio-Rad). Экстракцию гистоновой кислоты проводили в течение ночи при 4 ° C с использованием 0,2 н. HCl (химикат Spectrum) на осадке, который содержит интактные ядра. Обломки ядер удаляли центрифугированием при 6,500 × g в течение 10 мин при 4 ° C.Гистоны нейтрализовали 2М NaOH (Merck) перед кипячением в 1 × SDS-буфере Лэммли (Bio-Rad). Белки разделяли на 4-15% гелях SDS / PAGE (Bio-Rad) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Thermo Scientific). Мембраны блокировали 5% BSA при комнатной температуре в течение 2 часов и зондировали специфическими антителами в течение ночи при 4 ° C. Антитела против h3AX, против γ-h3AX и против β-актина были получены от Invitrogen, Biolegend и Sigma, соответственно. Вторичные антитела, связанные с HRP, антитела против мыши и антитела против кролика, связанные с HRP, были получены от Abcam и Cell Signaling Technology, соответственно.

Для обнаружения LC3A в клетках, инфицированных TRAMP C2, клетки лизировали и обрабатывали, как описано в Приложении SI .

Все блоты проявляли с использованием реагента ECL plus (Thermo Scientific), а полосы визуализировали с помощью системы визуализации ChemiDoc MP (Bio-Rad). Денситометрический анализ проводился с использованием ImageJ.

Статистический анализ.

Двусторонний непарный тест Стьюдента t был проведен для определения статистической значимости 95% достоверности между двумя сравниваемыми образцами.Статистическая значимость 95% достоверности между тремя или более группами определялась с помощью ANOVA с последующим тестом Тьюки. Вся статистика проводилась с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Статистическая значимость указана следующим образом: * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001.

Этическое заявление.

Исследования на животных прошли этическую проверку и были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Национального университета Сингапура в соответствии с руководящими принципами Национального консультативного комитета по исследованиям лабораторных животных.Национальный университет Сингапура — учреждение, аккредитованное Американской ассоциацией по уходу за лабораторными животными (Фредерик, доктор медицины).

Доступность данных.

Все данные доступны в основном тексте SI и приложении .

Благодарности

Мы благодарим Джеффа Миллера и Кристофера Тодда Френча (Калифорнийский университет, Лос-Анджелес) за предоставленные нам штаммы Burkholderia thailandensis ; Ли Шу Инь (Национальный университет Сингапура) за поддержку в области микроскопии; Mok Chee Keng (Национальный университет Сингапура BSL-3 Core Facility) за помощь в проведении экспериментов ABSL-3; Хайден Тан (Национальный университет Сингапура) за советы по процедуре нокдауна siRNA; и Heng-Phon Too (Национальный университет Сингапура) за любезный дар человеческих мезенхимальных стволовых клеток.Эта работа была поддержана Сингапурским национальным советом по медицинским исследованиям (NMRC / CBRG / 0052/2013), Министерством образования (MOE2018-T3-1-003) и Медицинской школой Йонг Лу Линь BSL-3 Core Facility и Национальным советом по медицинским исследованиям. , Центр Грант MINE, Исследовательский стержень № 4 (NMRC / CG / 013/2013).

Сноски

• Автор: J.W.K.K. и Ю.-Х.Г. спланированное исследование; J.W.K.K., Y.C. и Y.-H.G. проведенное исследование; Y.C., S.G. и K.C.C. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Дж.W.K.K., B.J.W.L., K.C.C. и Y.-H.G. проанализированные данные; и J.W.K.K. и Ю.-Х.Г. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.20067/-/DCSupplemental.

• Copyright © 2020 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

Инфинити Х 30.Тест-драйв Infiniti QX70S Дизайн: дата высокой четкости

Новый внедорожник Infiniti характеризуется как яркий, мощный и харизматичный внедорожник. Его дебют состоялся 29 ноября на популярной мировой выставке, которая проходила в Лос-Анджелесе в 2017 году.

Новая модель Infiniti QX50 2019-2020

Модель среднего размера с уютным интерьером. Infiniti QX50 2 2018-2019 модельного года сочетает в себе элегантность, практичность и мускулистость. Давайте подробнее рассмотрим характеристики и новый внешний вид премьерного Infiniti.

Разработчики постарались на славу и создали модную и стильную новинку, которая своим дизайном затмевает даже самые популярные варианты основных конкурентов, которые также были обновлены. Харизма нервюр на капоте и в районе боковин придает автомобилю яркость, установленные фары, отвечающие за головной свет, оснащены светодиодами.

вид сзади нового Infiniti

Есть верхняя решетка, это торговая марка.Передний бампер нового Infiniti KuX 50 отличается наличием большого количества аэродинамических деталей, придающих внешнему виду неповторимости … Вырезы под колесные арки специалисты называют просто огромными, а отличительную особенность придает стойка крыши, которая выглядит как ломаная линия.

Светодиодные габаритные огни и бампер оснащены дополнительными элементами (патрубками выхлопной системы) в виде трапеции. В целом дизайн автомобиля в новом кузове выражает его индивидуальность, мощь и мужественность при отсутствии агрессивности.

Интерьер Infiniti QX50 2018 — это отдельный разговор, эксперты оценили его роскошь, современность и деловой стиль. Внутреннее убранство впечатляет своей оригинальностью, оно трехцветное, производитель использует качественную кожу различных сортов. В отделке также присутствуют элементы из дерева, мягкого качественного пластика, мелкие детали из хромированного алюминия.

салон Infinity CuX50 2018

Такое сочетание материалов создает неповторимый интерьер и восхищает даже самых привередливых автомобильных журналистов.Кожа используется для всех элементов интерьера — руля, панели, дверей, подлокотников, сидений и даже ручки КПП.

Модель оснащена современным оборудованием, значительно облегчающим процесс управления внедорожником. Меня поразила интересная функция — проектор, у которого есть возможность отображать нужную информацию на стекле прямо перед водителем, то есть лобовое стекло.

Конечно, есть электропривод, удобные кресла.Пассажиры на заднем ряду могут ощутить оригинальное движение по кабине на уникальных санях.

Благодаря обновлению платформы, новая модель Infinity CuX 50 полностью изменила свои пропорции. Премьера существенно изменилась в габаритах, длина стала меньше на 51 мм, а ширина, наоборот, увеличилась на 102 мм. В высоту автомобиль также увеличился на 64 мм, но разработчики уменьшили колесную базу на 80 мм.

В результате мы узнали следующие размеры:

• Длина — 469.4 см;
• Ширина — 190,2 см;
• Высота — 167,9 см;
• Колесная база ок. 280 см;
• Дорожный просвет — 21,8 см.

Новое поколение комплектуется легкосплавными дисками, диаметр которых может составлять от 19 до 20 дюймов.

Для производства нового кузова внедорожника используется сверхпрочная сталь, которая имеет высокий уровень текучести — около 980 МПа. Вес самого кузова без дополнительного оборудования и покраски составляет примерно 419 кг, а уровень его жесткости также увеличен на 23 процента.

Что касается багажника Infiniti QX50 2018 года, то он вмещает 895 литров, при этом загрузка должна осуществляться под крышей. При сложении сидений этот объем увеличивается до 1048 литров.

Модель доступна в нескольких вариантах оснащения. Базовая комплектация — кожаный салон, электропривод и подогрев сидений, аудиосистема, климат-контроль. В цену также входит покраска в элегантный металлический цвет, алюминиевые диски, люк, доступ к двигателю без ключа зажигания, электрические стеклоподъемники, зеркала с подогревом.Установлены различные системы, контролирующие безопасность передвижения.

В качестве дополнительной опции предлагается смоделировать движение автомобиля и передать эту информацию в виде виртуального изображения на большой экран, который отображается в цветном режиме. Также можно установить датчики слежения и оповещения о ситуации на дороге.

Infiniti QX50 Технические характеристики

Кроссовер 2-го поколения оснащается бензиновым двигателем с шестью цилиндрами и V-образным двигателем VC-Turbo объемом 2.0 литров. Мощность составляет 272 лошадиные силы … Модель с передним или полным приводом, скорость до 230 км / ч. Разгон до 100 километров осуществляется всего за 6,7 секунды на полном приводе и за 6,3 секунды на переднем приводе … На сотню километров дороги требуется 8,6-9,2 литра.

Двигатель может работать в двух циклах и изменять не только степень сжатия, но и рабочий объем с 1997 см3 до 1970 см3, степень сжатия регулируется от 14: 1 до 8: 1 в зависимости от нагрузки.

Одной из особенностей автомобиля является наличие интеллектуальной настройки привода. Водитель может выбрать оптимальный тип многодисковой муфты, исключающей пробуксовку и оптимизирующей расход топлива.

Подвеска перед стойкой типа Макферсон независимая, а сзади многорычажная.

Infinity CuX 50 цены

в России начались 1 июля 2018 года. Стоимость строго зависит от комплектации и комплектации. Это:

Все кроссоверы идут только с полным приводом.

Видео тест-драйв Infiniti QX50 2019-2020:

Фото новой модели Infiniti KuX 50:

Как это случилось в японской компании, новый Infiniti QX50 2018 комплектации и цены будут выгодно отличаться от прайс-листов аналогичных кроссоверов Audi, BMW и Mercedes ниже. По доброй традиции — 2 500 000 рублей *, а разница между исходными комплектациями немецких моделей может достигать нескольких сотен тысяч рублей.Кроме того, после выхода Infiniti QX50 new нового поколения (фото) в конце текущего года в цену кроссовера с новым кузовом войдет недоступная для конкурентов новинка. Впервые в серийных технических характеристиках автомобиль представляет собой турбомотор с переменной степенью сжатия. Останется и полный привод, а сотрудничество с Mercedes будет означать наличие 9-ступенчатого автомата в качестве коробки передач. Комплектация нового кузова Infiniti QX50 2018 Новый вплотную приблизится к оснащению старшей модели с индексом «60», а стиль дизайна отражает дальнейшее развитие выбранного ранее направления, на которое ссылаются создатели. как «могучая элегантность».

Начальные цены Infinity Cu X 50 у официальных дилеров в Москве начинаются с отметки 2 500 000 рублей * и предполагают наличие двух богато оснащенных версий. Уже базовая комплектация Elite способна порадовать: кожаный салон, 2-х зонный климат-контроль, электрорегулировка передних сидений с подогревом, аудиосистема премиум-класса, адаптивные фары, камера заднего вида и электрорегулировка двери багажника. После этого неудивительно, что в infinity цена QX50 2018 года с новым кузовом будет включать: алюминиевые колесные диски, металлическую краску, люк, кнопку запуска двигателя, передние и задние электрические стеклоподъемники, зеркала с подогревом и электропривод. водить машину.Пассивная и активная безопасность: в исходной конфигурации предусмотрены: 6 подушек безопасности, система стабилизации, датчики дождя, света и давления в шинах, противотуманные фары, датчики парковки, беспроводной телефон в режиме громкой связи и система мониторинга слепых зон.

Flagship комплектация Hi- Tech , где цена Infiniti QX50 2 750 000 рублей *, дополнены: Российская навигационная система 08IT с информацией о ситуации на дорогах RDS-TMC и HDD диск, системы информирование о приближении объектов AOD и бесплатного парковочного места PSM, а также адаптивный круиз-контроль.Кроме того, кроссовер оснастят системой кругового обзора AVM, включающей 4 камеры и виртуальное изображение автомобиля на цветном дисплее, показывающее пространство вокруг. С точки зрения технических характеристик, все комплектации и цены Infiniti QX50 подразумевают наличие под капотом бензинового двигателя с турбонаддувом и переменной степенью сжатия 2,0 литра мощностью 272 л.с., полным приводом и 9- ступенчатая автоматическая коробка передач. Такой тандем позволяет достичь первой сотни за 6.5 секунд, заканчивая разгон на максимальной скорости 230 км / ч. Средний расход топлива составляет 6,7 литра на 100 км.

Технические характеристики

Главной изюминкой в ​​технических характеристиках нового Infiniti QX50 2018 года станет использование 2-литрового бензинового турбомотора с переменной степенью сжатия от 8: 1 до 14: 1. чем эффективнее мощность силового агрегата 272 л.с. и чем больше обороты, во избежание детонации происходит постепенное уменьшение степени сжатия до 8: 1 при полностью нажатой педали газа.Инновационный двигатель создаст достойную альтернативу заслуженной «шестерке» серии VQ, которая при аналогичном КПД потребляет на 30-35% больше топлива. Таким образом, Infiniti QX50 2018 по характеристикам новый оказался не хуже, чем показатели текущей версии с 3,7-литровым двигателем V6 для американского рынка, который разгоняется до 100 км / ч за 6,5 секунды, достигая 250 км. / ч максимальная скорость. При этом средний расход топлива уменьшился на 9,8 литра на 100 км, исходя из вышеупомянутой разницы в 30-35 процентов.

Кузов новый

Впервые новый кузов Infinity QX50 2018 (фото) был показан год назад в Китае в виде концепт-кара Sport Inspiration. Яркий и смелый внешний вид концепта на пути к конвейеру не потерял актуальности в лице предсерийного образца, представленного на Международном автосалоне в Детройте. Стремительный внешний вид нового кузова Infiniti QX50 2018 лишился только камер заднего вида вместо привычных зеркал, сохранена стремительность внешнего вида, а остальные элементы были немного переработаны для массового производства.Также в Детройте был впервые рассекречен интерьер долгожданной новинки, что при всей своей футуристичности не дает никаких сомнений в том, что перед нами финальная версия нового японского бренда кроссоверов премиум-класса. Отделка салона выполнена в трехцветной гамме, а материалы обивки: натуральная кожа, нубук, дерево и качественный мягкий пластик. Сами создатели характеризуют внешний вид нового кузова Infinity QX50 2018 как мускулистый и практичный, а элегантный изгиб задней стойки, призванный улучшить обзор и визуально удлинить линию крыши, представляет собой полумесяц.

Новое поколение

Без преувеличения можно сказать, что Infiniti нового поколения QX50 2018 new (фото) вместе с внедрением электронного рулевого управления в седанах Q-Series помогут укрепить имидж марки не только как производителя престижных автомобилей. , но также как новатор во внедрении технических изысков. Что касается кроссовера нового поколения, то речь идет об инновационном моторе с переменной степенью сжатия.Подобные агрегаты ранее демонстрировались, но только в виде прототипов, но теперь Infiniti QX50 2018 станет первым в мире, кто примерил аналогичный двигатель в серийном исполнении. В дальнейшем этот 2-литровый бензиновый агрегат будет устанавливаться на другие модели японской компании, составляя уверенного конкурента легендарным «шестеркам» серии VQ как по экономичности, так и по экономичности.

Дата выхода (старта продаж) в России

Новое поколение, существовавшее ранее в виде максимально приближенного к серийному производству образца, было успешно представлено в этом году.Дата выпуска Infiniti QX50 считается 29 ноября, а сам кроссовер уже будет считаться автомобилем 2018 модельного года. Судя по последним новостям, старт продаж Infiniti QX50 в России состоится летом будущего года. Более того, для выхода на наш рынок японский кроссовер должен пройти ужесточенные сертификационные испытания, связанные с необходимостью установки системы экстренного реагирования при авариях ЭРА ГЛОНАСС. Неплохо поднять infinity по цене QX50 2018 в глазах покупателей стоит японская сборка, что обычно означает: безупречное качество сборки, высокую надежность и долговечность нового автомобиля.А это, в свою очередь, позволяет надеяться на минимальные потери в остаточной стоимости и хорошую привлекательность кроссовера на вторичном рынке.

Infiniti QX50 2018 комплектация и цены

* — приблизительные данные

Новое поколение премиального кроссовера Infiniti QX50 2019-2020 года было официально представлено в первые дни автосалона в Лос-Анджелесе.Модель 2-го поколения, по сравнению со своей, изменилась буквально во всем, получив новую платформу, другие пропорции кузова, более просторный салон с совершенно другой компоновкой и принципиально новое техническое оснащение … Новинка пойдет. в продаже в США весной 2018 года, а в России желающим купить машину придется подождать как минимум до лета. Цена обновленного Infiniti QX50 2018-2019 на нашем рынке будет объявлена ​​позже, но, скорее всего, она будет колебаться в районе 2.5 млн руб. Остальная информация о внедорожнике, включая фотографии и технические характеристики, полностью раскрыта прямо сейчас, поэтому можно смело переходить к детальному обзору модели.

Особенности новой архитектуры кузова

Глобальное изменение концепции QX50 произошло, прежде всего, за счет перехода на новую платформу, унаследованную от «третьей». Фактически заднеприводную «тележку» заменили на переднеприводную, расположение двигателя стало не продольным, а поперечным.Кузов внедорожника в ходе модернизации серьезно увеличил свою жесткость, что является следствием широкого применения сверхвысокопрочных сталей (980 МПа), из которых все наиболее ответственные элементы конструкции, составляющие основу силовой каркас. В числовом выражении жесткость на кручение увеличилась на 23%.

Изменение технической базы серьезно повлияло на размер и пропорции кузова Infiniti QX50. В новой версии кроссовер на 51 мм короче, на 102 мм шире и на 64 мм выше предыдущей модели.Имея длину 4694 мм, ширину 1902 мм и высоту 1679 мм, Infiniti нового поколения вошла в число конкурентов. Наряду с пересмотренными размерами Ku X 50 получил и другую колесную базу, которая составила 2800 мм вместо 2880 мм. Дорожный просвет машины увеличился со 165 до 218 мм. Доработанная техника и габариты кузова красноречиво говорят о том, что QX50 в результате обновления превратился в полноценный кроссовер, тогда как раньше он больше походил на приподнятый хэтчбек.

Стильный дизайн

Несмотря на довольно существенные изменения внешнего вида Infiniti QX50 намекает на каждую деталь японского премиального бренда. Спереди новинка красуется фирменной крупной решеткой радиатора с характерными ромбовидными ячейками, узкими фарами с современными модулями светодиодной оптики и эффектными штрихами ходовых огней, оригинальным бампером с аккуратными секциями воздухозаборников, капотом с агрессивным рельефом ребер.

Фото Infiniti QX50 2018-2019

Задняя часть внедорожника оформлена не менее ярко, чем носовая часть.Его украшают стильные габаритные огни, визуально объединенные хромированной аркой, а также мощный бампер с двумя большими трапециями выхлопных труб.

Новый дизайн задней части QX 50

При осмотре автомобиля сбоку выявляется стремительный силуэт с изящными линиями, интересный зигзаг задних стоек крыши, очерченный тонкой хромированной полосой оконных рам и большие колесные арки, в которые легко помещаются 19 или 20-дюймовые диски, «обуты» в резину 235/55 R19 или 255/45 R20.Кстати, в моделях используются шины Run Flat со специальными усиленными боковинами, которые позволяют при проколе колеса добраться до ближайшего шиномонтажа, даже если он находится на расстоянии 150 км.

Новый профиль продукта

Ассортимент эмалей кузова нового Infiniti QX50 будет варьироваться в зависимости от рынка продаж, но уже известно, что гамма оттенков порадует своей насыщенностью. Покупатели смогут рассчитывать как минимум на пять цветов: Liquid Platinum, Majestic White, Eclipse Black, Chestnut Bronze и Graphite Shadow.В США эту палитру дополнят еще четырьмя цветами, в Китае — двумя.

Интерьер и оборудование

Интерьер нового кроссовера Infiniti претерпел глубокую реформу, благодаря чему он стал максимально удобным для пассажиров обоих рядов сидений. Разумеется, наиболее удобные сиденья отведены водителю и гонщику по правую руку. Они смогут оценить все преимущества новых сверхкомфортных сидений с анатомической регулировкой, оснащенных электроприводом, подогревом и вентиляцией.На втором ряду после модернизации появилось значительно больше места как в плечевой области (сказывается увеличенная ширина), так и в области колен.

Новый салон QX50

Задний диван теперь может скользить по салону, освобождая дополнительное пространство для ног или увеличивая объем багажного отделения. Если отодвинуть сиденья до упора, то расстояние между спинками двух рядов сидений составит внушительные 983 мм, а в грузовом отсеке можно хранить до 895 литров (загрузка под потолком).Полное переднее положение обеспечивает вместимость 1048 литров, которая при сложении заднего ряда легко увеличивается до 1699 литров.

Несколько блоков будут отвечать за информационную поддержку пассажиров и развлекательную составляющую в новом Infiniti Ku X 2-го поколения. Прежде всего, это два дисплея InTouch на центральной консоли. Верхний 8-дюймовый экран предназначен для отображения навигационных карт и системных сообщений, нижний 7-дюймовый экран — для управления климатическими и мультимедийными настройками.Климат-контроль в QX50, кстати, трехзонный, позволяющий задним пассажирам менять температуру. Если вернуться к комплексу InTouch, то в нем самый современный функционал с возможностью простой интеграции гаджетов, а также два метода управления: прикосновение или с помощью шайбы на центральном туннеле.

Мультимедийный комплекс

Помимо основного мультимедийного комплекса, бортовые данные способны транслировать информационное табло (расположенное между классическими аналоговыми шкалами) и 9-дюймовый проекционный дисплей.Ряд функций настраивается с помощью кнопок на рулевом колесе, которое имеет удобный захват, что исключает утомляемость рук при длительной езде.

Шайба контроля среды

Мы не будем подробно останавливаться на материалах отделки, так как очевидно, что здесь они исключительно качественные. Причем кожа лучших сортов используется не только для обивки сидений и дверных карт, но и для обивки передней панели. Цветовые сочетания, конечно же, выбираются только для радующих глаз.Теперь остановимся на еще не упомянутом, но доступном новом оборудовании QX50. Сюда входят подогрев руля и задних сидений, панорамная крыша с сдвижным люком, электрическая задняя дверь с функцией бесконтактного открывания с поворотом ноги под бампером, электронный стояночный тормоз, камеры кругового обзора (Around View Monitor ), подсветка с регулируемой интенсивностью, ионизатор воздуха, акустика премиум-класса Bose Performance с 16 динамиками и системой активного шумоподавления.

Внутренняя отделка

В помощь водителю Infiniti QX50 был отправлен комплекс безопасности ProPilot.Он включает в себя предупреждение о лобовом столкновении, автоматическое торможение с обнаружением пешеходов, отслеживание полосы движения, мониторинг слепых зон, интеллектуальный круиз-контроль, адаптивное рулевое управление с прямым адаптивным рулевым управлением (DAP).

Технические характеристики Infiniti QX50 2018-2019

Место под капотом Infiniti QX 50 занял неоспоримый 2,0-литровый двигатель VC-Turbo, являющийся настоящим сокровищем инновационных решений. Главная «особенность» агрегата — встроенный механизм коррекции положения верхних мертвых точек (ВМТ).При малых нагрузках смещается вверх, при высоких — вниз. Параллельно с перемещением ВМТ изменяется степень сжатия (варьируется от 14,0: 1 до 8,0: 1) и рабочий объем (с 1997 по 1970 куб. См). Среди других особенностей двигателя отметим наличие двух рабочих схем (по циклам Отто и Аткинсона), комбинированной системы впрыска, активной верхней опоры Active Torque Rod (генерирует колебания, противоположные по фазе, снижая общий уровень вибрации. блока питания).Все применяемые технологии позволили «снять» с двигателя мощность 272 л.с. (при 5600 об / мин) и крутящий момент 380 Нм (при 4400 об / мин).

Двигатель 2.0 VC-Turbo с переменной степенью сжатия

Одинарный двигатель сочетается с одним вариантом трансмиссии — 8-диапазонным вариатором. В базовых версиях кроссовера тяга направлена ​​только на переднюю ось, в топовых модификациях доступен подключаемый полный привод с установленной многодисковой муфтой передней задней оси.Максимально на задние колеса передается 50% тяги (это бывает, например, при трогании с места).

Рулевое управление нового QX50 имеет два варианта: стандартное с электроусилителем и дополнительное прямое адаптивное рулевое управление. Во втором случае между рулем и колесами отсутствует механическая связь, а передача команд осуществляется по проводам. Усилие рулевого управления регулируется путем выбора одного из трех режимов — По умолчанию, Динамический и Динамический +. Также в арсенале внедорожника есть селектор комплексного изменения ходовых характеристик.Он предоставляет четыре режима — Стандартный, Эко, Спорт и Персональный. Каждый из них влияет, помимо прочего, на работу адаптивных амортизаторов. Подвеска кроссовера, кстати, теперь построена по новой схеме: спереди — штатная стойка Макферсон, сзади — многорычажная.

Если говорить о параметрах экономичности, то новая модель Infiniti будет потреблять в среднем около 8,7-9,1 л / 100 км. Одноклассники в этом плане чуть более «прожорливы».А вот динамические характеристики японской машины супер-выдающиеся. Переднеприводный QX50 тратит около 6,7 секунды на разгон от 0 до 97 км / ч, полноприводный — около 6,3 секунды. «Максимальная скорость» для обеих версий ограничена 230 км / ч. Такую же, а то и лучшую динамику демонстрируют конкуренты от Mercedes и Audi.

Фото Инфинити QX50 модель 2019-2020

Infiniti Q30 — результат сотрудничества японской и немецкой автомобильной промышленности.Что еще может быть лучше? В статье представлены технические характеристики, фото, видео и комплектация Infiniti Ku30.

Действительно, полный привод, клиренс 178 миллиметров, и надо сказать, что Infiniti Ku30 превосходит свою соплатформенную GLA во всем. Немец по сравнению с японцем проигрывает по всем параметрам, от дизайна до мультимедиа. Более того, в стране восходящего солнца решили, что не стоит ограничиваться одним МБ, нужно собирать силовые агрегаты со всего мира.Так, например, здесь в модельном ряду можно найти 109-сильный двигатель Renault, но для России он недоступен.

Infiniti Q30 design

Капот — это утопленные, изогнутые, огромные колесные арки, заполненные колесами от 17 до 19 дюймов по спецификации. Кстати, в соплатформе можно найти даже 16 дюймов. Особого внимания заслуживает оптика. По задумке производителя это глаз, надо сказать очень похожий. Здесь спрятана светодиодная матрица, которая умеет заглядывать в поворот.

Корм ​​здесь, конечно, ни на что не похож. Хэтчбек полностью добил всех своих конкурентов.В нем столько экспрессии в сочетании с изяществом и элегантностью. Отсюда Infiniti Q30 выглядит подавленным, мускулистым, подтянутым. Широкая колея плавно переходит в узкую крышу, а продолжение волнообразных форм видно здесь в фонарях и ободке номерного знака. Сразу хочется отметить грубую ошибку дизайнеров, да и бренда в целом. Глянцевый черный пластик, конечно, красив, он полностью подчеркивает огромные хромированные патрубки выхлопной системы, но очень непрактичный, особенно для нашей страны.

Интерьер Infinity Q30

Панель приборов отличается от большинства вертикальным нулевым положением стрелок и светится как новогодняя елка. В отличие от Renault, здесь стрелочный указатель температуры уже в базовой конфигурации … В центре есть небольшой дисплей, показывающий показания многих систем, например бортового компьютера, систем контроля полосы движения, распознавания дорожных знаков, предотвращения лобового столкновения. , показывает расстояние до впереди идущей машины и многое другое.Нужны они или нет — каждый решает сам.

Infiniti Q30 Технические характеристики

Итак, первый силовой агрегат, который предлагается в России (а у нас линейка двигателей снова сильно сократилась) — это бензиновый двигатель мощностью 149 лошадиных сил. Кстати, в Европе он заявлен как 156-сильный, ну да ладно. Это бензиновая турбо четверка, которая ездит исключительно на породистом корме АИ-98. Стадо развивает 250 Нм крутящего момента. Этого, надо сказать, достаточно, чтобы почувствовать плавный, но достаточно быстрый разгон до сотни за 9,2 секунды.

Максимальная скорость остановилась на отметке 210 км / ч.В городе такой двигатель будет потреблять 7,7 л бензина; по трассе потребуется не более 6 литров. Такой мотор работает в паре с неоспоримой 7-ступенчатой ​​роботизированной коробкой с двумя мокрыми сцеплениями. Одно сцепление здесь обслуживает четные передачи, а другое — нечетные. Двигатель 1.6 комплектуется только передним приводом.

Второй двигатель для российского рынка — это двухлитровая турбо четверка, тоже на бензине. Есть уже 211 лошадей, 350 Нм крутящего момента и 7,3 секунды до сотни. Если оценить массу автомобиля в полторы тонны, то это очень хорошо.Максимальная скорость была 230 км / ч, да и двигатель не сильно прожорливал. В смешанном цикле ему потребуется не более 6,9 литров бензина.

Консенсусное руководство по определению, обнаружению и интерпретации иммуногенной гибели клеток

Введение

Регулируемая гибель клеток (RCD), форма гибели клеток, которая регулируется генетически кодируемым молекулярным механизмом, 12 долгое время считалась иммунологически тихое или даже толерогенное событие.3 По крайней мере частично, это широко распространенное мнение возникло из очень толерогенной природы запрограммированной гибели клеток (PCD), физиологического варианта RCD, который способствует постэмбриональному развитию и обновлению тканей взрослого человека.1 4 Однако теперь стало ясно, что, по крайней мере, при определенных обстоятельствах индуцированный стрессом RCD может вызывать воспалительную реакцию, которая может завершиться активацией управляемого цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) адаптивного иммунитета в сочетании с установлением долговременной иммунологической памяти.Такую функционально уникальную форму вызванного стрессом RCD теперь обычно называют иммуногенной гибелью клеток (ICD) 5.

Клеточные стрессоры, связанные с МКБ, включают (но не ограничиваются ими): (1) облигатные внутриклеточные патогены, включая несколько видов бактерий и вирусов6–8; (2) терапевтические онколитические вирусы9–16; (3) различные молекулы с онколитическим потенциалом 17–19; (4) обычные химиотерапевтические препараты, такие как многочисленные антрациклины (например, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин и митоксантрон), некоторые (но, что важно, не все) повреждающие ДНК агенты (например, циклофосфамид и оксалиплатин, но не цисплатин), поли-A-рибозополимераза (PARP) ингибиторы, митотические яды (например, доцетаксел и патупилон) и ингибиторы протеасомы (например, бортезомиб и карфилзомиб) 20-25; (5) эпигенетические модификаторы, включая ДНК-метилтрансферазу, гистондеацетилазу (HDAC) и ингибиторы бромодомена 26-30; (6) нацеленные противораковые агенты, такие как ингибитор тирозинкиназы кризотиниб, специфическое к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) моноклональное антитело цетуксимаб, ингибитор циклин-зависимой киназы (CDK) динациклиб и ингибитор тирозинкиназы Брутона (BTK31–33). ; (7) другие химические вещества, включая убиквитинспецифический ингибитор пептидазы спаутин-1, антибиотик блеомицин, ингибитор протеинфосфатазы-2A LB-100, компонент китайской фитотерапии шиконин и капсаицин 34–38 и (8) многочисленные физические вмешательства, включая различные формы ионизирующего излучения, экстракорпоральная фотохимиотерапия, фотодинамическая терапия на основе гиперицина (ФДТ), фотоиммунотерапия в ближнем инфракрасном диапазоне, высокое гидростатическое давление, тяжелый цитотоксический тепловой шок, наноимпульсная стимуляция и электрогипертермия.39–49 Важно отметить, что режимы доз и введения имеют большое влияние на способность многих из этих агентов инициировать продуктивную МКБ 50–52.

Вышеупомянутые индукторы ICD сыграли важную роль не только для идентификации молекулярного механизма, лежащего в основе иммуногенности некоторых вариантов RCD, 5 но также для выяснения патофизиологических и терапевтических последствий этого процесса53. иммунитет не только имеет решающее значение для оптимального искоренения инфекционных патогенов, 54 но также влияет на цикл рака-иммунитета, изменяя баланс в сторону противоопухолевого иммунитета.55 В соответствии с этим представлением, как патогены, так и прогрессирующие опухоли используют стратегии, которые обеспечивают иммуноэвазию, избегая индукции ИКД.5 Более того, накопление клинических данных демонстрирует, что многочисленные индукторы ИКД, обычно используемые при лечении онкологических больных, взаимодействуют с иммунотерапией с блокаторами иммунных контрольных точек (ИКБ). при условии, что они не нарушают иммуностимулирующие сигналы или активность лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль.56 57

Морфологические особенности умирающих клеток и молекулярные механизмы, которые механически ответственны за гибель клеток, не обязательно коррелируют с иммуногенностью RCD.58 Таким образом, хотя конкретные случаи апоптоза, зависящего от каспазы 3 (CASP3), и некроптоза, зависимого от домена киназ смешанного происхождения (MLKL), инициируют адаптивный иммунитет в определенных экспериментальных условиях, 20 59 60 RCD, сопровождаемый активацией CASP3 или MLKL, не обязательно иммуногенный.61–63 Более того, хотя восприятие RCD как иммуногенного было этиологически связано с испусканием специфических сигналов от умирающих клеток (см. Определение гибели иммуногенных клеток ), наличие таких сигналов не обязательно является предиктором способности умирающих клеток для управления адаптивным иммунитетом in vivo.34 64 В целом эти наблюдения подчеркивают важность определения стандартизированных экспериментальных условий, которые позволяют оценивать МКБ в контексте надежной концептуальной основы для интерпретации результатов. Здесь мы даем общий обзор факторов, которые лежат в основе иммуногенности или RCD, и пытаемся предоставить такую ​​основу, формулируя руководящие принципы для определения, обнаружения и интерпретации ICD.

Определение МКБ

Номенклатурный комитет по клеточной смерти недавно определил МКБ как «форму RCD, достаточную для активации адаптивного иммунного ответа у иммунокомпетентных сингенных хозяев» 1, что правильно отражает два основных компонента ICD как процесс, то есть клеточный компонент и хост-компонент.Важно отметить, что последнее относится не к потенциальным дефектам хозяина, которые препятствуют инициации адаптивного иммунитета (например, несоответствие HLA, системный иммунодефицит), а к особенностям, присущим умирающим клеткам, которые делают их иммуногенными только у определенных хозяев. Действительно, способность RCD управлять адаптивным иммунитетом зависит от двух основных параметров, ни один из которых в конечном итоге не присущ умирающим клеткам: антигенность и адъювантность.

Антигенность обеспечивается экспрессией и представлением антигенов, которые не могут индуцировать клональную делецию в контексте центральной толерантности у конкретного хозяина, что подразумевает, что хозяин содержит клоны наивных Т-клеток, которые могут распознавать такие антигены.65 66 Таким образом, здоровые клетки ограничены в своей способности управлять ICD, поскольку их антигены обычно экспрессируются эпителием тимуса во время развития Т-клеток. В качестве исключения некоторые наивные клоны Т-клеток, экспрессирующие аутореактивные низкоаффинные Т-клеточные рецепторы (TCR), избегают селекции тимуса, подразумевая, что такие антигены могут поддерживать ICD в контексте нарушения периферической толерантности (см. Источники антигенности ICD, ). Напротив, инфицированные клетки, а также злокачественные клетки проявляют достаточную антигенность для стимулирования иммунных ответов, поскольку они экспрессируют панель антигенных эпитопов, для которых обычно доступны наивные клоны Т-клеток.Эти антигенные детерминанты включают неоэпитопы, которые обладают высокой иммуногенностью, поскольку они не покрываются центральной толерантностью, а также (немутантные) эпитопы, которые могут быть иммуногенными из-за пробелов в центральной толерантности и / или неполной периферической толерантности.67 Адъювантность обеспечивается пространственно-временной скоординированное высвобождение или воздействие сигналов опасности, необходимых для набора и созревания антигенпрезентирующих клеток (APC), которые в совокупности называются молекулярными паттернами, связанными с повреждениями (DAMP).68 69 Хотя большинство (если не все) клетки содержат DAMP в количествах, достаточных для стимулирования мощной стимуляции APC, кинетика и интенсивность их высвобождения продиктованы внутриклеточными реакциями, управляемыми инициирующим стрессором. 70–72 Это может объяснить, почему некоторые цитотоксические вещества агенты могут управлять ICD, в то время как другие не могут, несмотря на их аналогичную способность вызывать RCD23 73

Условия микросреды также оказывают сильное влияние на склонность инфицированных или неопластических клеток, подвергающихся потенциально иммуногенному варианту RCD, инициировать адаптивный иммунитет и / или быть чувствительными к CTL-зависимому лизису, таким образом влияя как на фазу праймирования, так и на эффекторную фазу иммунологический ответ.Например, раковые клетки мышей, облученные in vitro, можно успешно использовать для иммунизации иммунокомпетентных сингенных мышей против последующего заражения живыми клетками того же типа, демонстрируя активацию иммунологической памяти.74 И наоборот, в терапевтических условиях иммуносупрессивное микроокружение, которое характеризует Большинство опухолей могут значительно ограничивать иммунитет, управляемый МКБ.75 76 Таким образом, облучение опухолевого поражения, установленного у иммунокомпетентных сингенных мышей, обычно не вызывает CTL-зависимый иммунный ответ достаточной силы для устранения отдаленного необлученного поражения, если только предусмотрены дополнительные иммуностимулирующие молекулы.77–79

В совокупности эти наблюдения предполагают, что, хотя адъювантность RCD зависит от умирающих клеток и способности инициирующего стрессора вызывать передачу сигналов об опасности, его иммуногенность в конечном итоге зависит от умирающих клеток и хозяина, что также определяет склонность умирающих клеток к управлять адаптивным иммунитетом на уровне микросреды (рисунок 1).

Основные факторы, определяющие иммуногенность гибели клеток. Клетки, претерпевающие регулируемую клеточную смерть (RCD) в ответ на стресс, могут инициировать адаптивный иммунный ответ, специфичный для антигенов, связанных с мертвыми клетками, при условии, что (1) эти антигены не полностью покрываются центральной толерантностью, и (2) умирающие клетки испускают панель молекулярные паттерны, связанные с иммуностимулирующим повреждением (DAMP) и цитокины, которые при доставке в соответствии с точным пространственно-временным паттерном поддерживают рекрутинг, фагоцитарную активность и созревание антигенпрезентирующих клеток (APC), де-факто позволяя им поглощать антигенный материал, мигрировать в лимфатические узлы и запускают цитотоксический Т-лимфоцит (CTL) -зависимый иммунный ответ.Поскольку они экспрессируют опухолевые неоантигены (TNA, которые не покрываются центральной толерантностью) и / или ассоциированные с опухолью антигены (TAA, для которых центральная толерантность является негерметичной), раковые клетки могут претерпевать добросовестную иммуногенную гибель клеток (ICD) в ответ на выбор стимулы, включая (но не ограничиваясь ими) некоторые химиотерапевтические агенты, обычно применяемые в клинике, а также лучевую терапию. Однако TME обычно характеризуется иммуносупрессивным профилем, который может предотвращать либо инициирование, либо выполнение управляемого ICD противоопухолевого иммунитета.Таким образом, окончательная способность RCD управлять адаптивным иммунитетом зависит не только от инициирующего стимула и умирающей клетки, но также от свойств, присущих хозяину. IFNAR, рецептор интерферона-альфа / бета; PRR, рецептор распознавания образов; T _REG , нормативный T; TME, микросреда опухоли.

Источники антигенности по МКБ

Заражение патогенными микробами является очевидным источником антигенных детерминант, поскольку микробные белки не покрываются центральной толерантностью и, следовательно, их эпитопы обладают высокой антигенностью.80 81 Вместе со способностью консервативных микробных продуктов, совокупно называемых микробами-ассоциированными молекулярными структурами (MAMP), передавать мощные иммуностимулирующие сигналы, это объясняет, почему RCD, управляемый внутриклеточными патогенами, является высоко иммуногенным. 82–84 То же самое обычно не относится к здоровые сингенные клетки, поскольку тимическая и периферическая толерантность приводят к удалению или функциональной инактивации самореактивных клонов Т-клеток из репертуара зрелых Т-клеток хозяина, 85 хотя некоторые наивные клоны Т-клеток, экспрессирующие аутореактивные низкоаффинные ТКО, могут избежать отбора тимуса и, следовательно, влечение (особенно в контексте утраты периферической толерантности) аутоиммунные реакции.86

Есть по крайней мере два исключения из этого принципа, которые могут лежать в основе способности здоровых клеток проходить ICD. Во-первых, геном нормальных клеток содержит значительное количество эндогенных ретровирусов, которые, как правило, являются латентными (т. Е. Не транскрибируются) в физиологических условиях.87 88 Однако в ответ на некоторые клеточные стрессоры эндогенные ретровирусы могут стать активированными и / или ретровирусными генами. могут быть экспрессированы, что приводит к синтезу потенциально антигенных белков.89 Во-вторых, антигенные детерминанты могут быть получены ферментативными или неферментативными посттрансляционными модификациями (PTM), которые изменяют структуру белка, включая (но, возможно, не ограничиваясь) фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование, цитруллинирование, нитрование / нитрозилирование, гликозилирование, окисление и др. убиквитинирование.90 Более того, репертуар антигенных пептидов может быть усилен за счет изменений в активации ретикулярных аминопептидаз, таких как аминопептидаза 1 эндоплазматического ретикулума (ERAP1) и ERAP2.91 Важно отметить, что каскады передачи сигналов, которые регулируют ферментативные PTMs, чувствительны к множеству сигналов микроокружения и не обязательно активируются сходным образом на периферии и в эпителии тимуса во время отбора клональных Т-клеток. Это означает, что некоторые PTM-содержащие эпитопы не могут быть охвачены центральной толерантностью. Аналогичным образом, условия микросреды, которые накладывают неферментативные ПТМ (например, окислительная внеклеточная среда), обычны в местах воспаления, ишемии или злокачественного прогрессирования, но не в тимусе.92 Следует отметить, что такие стрессовые условия также могут приводить к образованию антигенных пептидов, полученных в результате «скрытой» трансляции (т. Е. Из нетранслируемых мРНК) .93 В поддержку способности здоровых клеток управлять МКБ, по крайней мере, в некоторых условиях, PTM-зависимые эпитопы приписывают патогенное значение при некоторых аутоиммунных заболеваниях, включая диабет и ревматоидный артрит.94 95

Большинство опухолей человека не вызываются активными вирусными инфекциями. Тем не менее, как и умирающие клетки, инфицированные патогенами, злокачественные клетки могут проявлять высокую антигенность, что в значительной степени отражает повышенную скорость мутаций, которая часто сопровождает злокачественную трансформацию и прогрессирование заболевания в контексте иммуноэвазии.96 97 В некоторых случаях такие мутации вызывают иммунные реакции, поскольку они влияют на кодирующие области генома. Это случай несинонимичных точечных мутаций (т. Е. Мутаций, изменяющих аминокислотную последовательность), а также мутаций сдвига рамки считывания, вызванных небольшими вставками и делециями (инделениями) в белках, которые экспрессируются и должным образом обрабатываются механизмом презентации антигена, что приводит к воздействие опухолевых неоантигенов (ТНК). ТНК, экспонированные на поверхности злокачественных клеток, могут иметь плохую структурную гомологию с собственными эпитопами, поэтому частично напоминают микробные эпитопы и эффективно инициируют иммунные ответы de novo.75 98–101 Некоторые аутоантигены, экспрессируемые раковыми клетками, также могут инициировать противоопухолевый иммунитет. Поскольку они не являются уникальными для неопластических тканей, но также экспрессируются здоровыми или иммунопривилегированными тканями, такие антигены были названы антигенами, ассоциированными с опухолью (ТАА). TAA, которые, как было показано, управляют противоопухолевым иммунитетом, особенно в условиях терапевтической противоопухолевой вакцинации, 102 103 включают: (1) антигены тканевой дифференциации, такие как CD19, CD20, премеланосомный белок (PMEL, наиболее известный как gp100) и мелан-A (MLANA, наиболее известный как MART-1), а также (2) эктопически экспрессируемые белки, такие как карциноэмбриональные антигены (CEA), раковые / семенниковые антигены, а также множественные члены семейств белков MAGE и SSX.104–106 Центральная толерантность к этим антигенам непостоянна (это означает, что доступны наивные Т-клеточные клоны, экспрессирующие TCR с низким сродством), и периферическая толерантность может быть преодолена в контексте сильной адъювантности. 106–108 Таким образом, хотя TAA обычно слабее вызывая противоопухолевый иммунитет по сравнению с TNA, 109 они могут иметь отношение к ICD-управляемому иммунитету в опухолях с низкой нагрузкой TNA. Следует отметить, что суровые условия, которые характеризуют микроокружение опухоли (TME), и обширная перестройка передачи сигнала, которая характерна для злокачественных клеток, предполагают, что PTM могут играть преобладающую роль в определении антигенности раковых клеток, возможность, которая остается в значительной степени неизученной.110

Несколько факторов влияют на антигенность опухолей, развивающихся у иммунокомпетентных сингенных хозяев. Во-первых, мутационная нагрузка (и, следовательно, возможность генерирования TNA) неоднородна в пределах опухолей и внутри них и варьируется от ~ 1 мутации на Мб при гематологических злокачественных новообразованиях до> 10 мутаций на Мб в солидных опухолях с гипермутантным фенотипом111–113 Мутационная нагрузка. и ландшафт TNA также развивается в пространстве (то есть в отдельных областях опухоли) и во времени (то есть на разных стадиях злокачественного прогрессирования) под давлением постоянного иммунитета и в ответ на усиление геномной нестабильности, а также химиотерапевтические или радиотерапевтические вмешательства, 97 114 115 приводя к опухолям или областям опухоли с отчетливой антигенностью и, следовательно, с различной способностью управлять адаптивными иммунными ответами на RCD.116 При этом, хотя мутационная нагрузка была связана с чувствительностью множественных опухолей к ICB 117–119, а опухоли с обширной иммунной инфильтрацией (которые часто являются генетически нестабильными) характеризуются транскрипционной сигнатурой ICD, 120 формальная демонстрация того, что мутационная нагрузка также влияет на противоопухолевые эффекты терапевтических схем на основе ИКД в клинике отсутствуют. Доклинические данные свидетельствуют о том, что даже клетки с пониженной мутационной нагрузкой могут управлять адаптивным иммунитетом, 121 хотя ожидается, что выбор экспериментальной модели будет играть важную роль в этом контексте (см. Выявление МКБ при раке ).Во-вторых, антигенность злокачественных клеток напрямую связана с презентацией антигена, подразумевая, что генетические и эпигенетические дефекты, которые ставят под угрозу ее, могут быть полезны для раковых клеток.122 123 Эти дефекты, которые часто встречаются в опухолях с высокой мутационной нагрузкой и устойчивой инфильтрацией Т-клеток, 124 125 включают: (1) потерю антигена и субклональную эволюцию, то есть преимущественное разрастание клонов раковых клеток, которые не экспрессируют антиген, подверженный активному иммунитету114, и (2) нарушение презентации антигена в результате мутаций, дерегулированной экспрессии или структурные изменения ключевых компонентов антиген-презентирующего аппарата, включая молекулы MHC класса I, бета-2-микроглобулин (B2M), транспортер 1, член подсемейства B АТФ-связывающей кассеты (TAP1), TAP2 и протеасомные субъединицы.125 126

Следует отметить, что, хотя считается, что большинство индукторов ИКБ оказывают незначительное влияние на антигенность и действуют, управляя правильным пространственно-временным выбросом DAMP в контексте гибели клеток (см. Источники адъювантности МКБ, ), по крайней мере, некоторые МКБ Режимы запуска могут также повысить антигенность. Это относится к потенциально мутагенным агентам и вмешательствам, которые вызывают реактивацию эндогенных ретровирусов и / или вызывают экспрессию мутированных генов или TAA, таких как ингибиторы CDK4 / CDK6, 127 ионизирующее излучение, 79 128 ингибиторов ответа на повреждение ДНК (DDR), 129 130 онколитических вирусов131 или ингибиторов HDAC и других эпигенетических регуляторов.132–134 Независимо от этой возможности, способность RCD управлять адаптивным иммунитетом тесно зависит от антигенности умирающих клеток в отношении доступности и функционального статуса репертуара зрелых TCR хозяина.

Источники адъювантности ICD

ICD, управляемый микробными патогенами, вероятно, связан с наиболее мощными сигналами адъюванта для организмов млекопитающих, MAMPs. MAMP включают в себя множество микробных продуктов, которые действуют как внутри инфицированных клеток, так и в их микроокружении, чтобы управлять набором и созреванием APC, что завершается (перекрестной) презентацией антигена наивным Т-клеткам.MAMP включают виды микробных нуклеиновых кислот (например, вирусные одноцепочечные или двухцепочечные РНК или ДНК, бактериальные CpG-богатые ДНК), а также структурные компоненты (например, липополисахарид, пептидогликаны, флагеллин) и в основном опосредуют иммуностимулирующие эффекты через распознавание образов. рецепторов (PRR) .82 83 Последние включают многочисленные Toll-подобные рецепторы (TLR), экспрессируемые на поверхности клетки и в эндосомных компартментах, 135–138, а также (1) циклическую GMP-AMP-синтазу (CGAS), сенсор цитозольного двухцепочечная ДНК (дцДНК) 139; (2) RIG-I-подобные рецепторы (RLR), группа РНК-специфичных PRR, названных в честь DExD / H-бокс-геликазы 58 (DDX58, наиболее известной как RIG-I) 140 141; (3) NOD-подобные рецепторы (NLR), семейство PRR с широкой лигандной специфичностью, названное в честь общего нуклеотид-связывающего домена олигомеризации (NOD) 142 143; (4) Z-ДНК-связывающий белок 1 (ZBP1), сенсор нуклеиновой кислоты, также известный как DAI, точный механизм активации которого остается неизвестным144; (5) гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A2 / B1 (HNRNPA2B1), сенсор вирусной ядерной ДНК и РНК, несущих N6-метиладенозин.145 146 PRR стимулируют выработку множества иммуностимулирующих средств, которые являются ключевыми для контроля патогенов иммунной системой147.

Те же самые PRR, активированные MAMP, также участвуют в адъювантности ICD, индуцированной в раковых клетках немикробными стимулами.68 148 Таким образом, злокачественные клетки, подвергшиеся воздействию потенциально иммуногенного индуктора RCD, испускают многочисленные DAMP и цитокины, которые были механистически связаны с инициирование адаптивного иммунитета на доклинических моделях (таблица 1). Эти иммуностимулирующие молекулы включают (но, скорее всего, не ограничиваются ими): АТФ, 149 150 клеточных нуклеиновых кислот, 151 152 негистоновые, ядерный ДНК-связывающий белок с высокой подвижностью, блок 1 группы (HMGB1), 153–156 член группы суперсемейство аннексинов аннексин A1 (ANXA1), 157 цитокинов, таких как интерферон I типа (IFN), хемокиновый лиганд 2 с мотивом CC (CCL2), хемокиновый лиганд 1 с мотивом CXC (CXCL1) и шапероны CXCL10,151 158 159 ER, такие как кальретикулин (CALR), белок член 3 семейства дисульфидизомераз A (PDIA3, также известный как ERp57), член 1A семейства белков теплового шока A (Hsp70) (HSPA1A, наиболее известный как HSP70), член 1 класса A семейства Hsp90 альфа (HSP90AA1, наиболее известный как HSP90), 21 22 160 цитозольные компоненты, такие как F-актин, 161 и другие митохондриальные продукты, такие как ДНК, активные формы кислорода (ROS), кардиолипин и фактор транскрипции A, митохондрии (TFAM).36 162–164 Основными функциями ICD-ассоциированных DAMP и цитокинов являются: (1) обеспечение рекрутирования APC или их предшественников в сайты RCD (например, ATP) 149 150 165, (2) пространственное управление взаимодействием между APC. и умирающие клетки (например, ANXA1) 157, (3) способствуют фагоцитозу умирающих клеток или их трупов (например, CALR, ERp57, HSP70, HSP90, F-actin) 21 22 160 161, (4) способствуют созреванию APC и их способность влиять на перекрестную презентацию (например, АТФ, HMGB1, IFN типа I и TFAM), 149, 153, 166–168 и (5), способствуют привлечению Т-клеток (например, CCL2, CXCL1 и CXCL10).151 158 Следует отметить, что некоторые выделяемые DAMP являются иммуносупрессивными (например, аденозин), 169 в то время как другие могут переключаться на противовоспалительные в зависимости от задействованного PRR (например, HMGB1), биохимических модификаций, таких как окисление (например, HMGB1) или хроническое высвобождение ( например, IFN типа I) .53 70 170 В самом деле, хотя острые, устойчивые воспалительные реакции, такие как вызванные ICD, в конечном итоге вызывают противоопухолевый иммунитет, вялотекущее хроническое воспаление неизменно связано с иммуноэвазией и прогрессированием опухоли.171 Следует отметить, что выделение ДАМФ умирающими клетками происходит в контексте неэффективных внутриклеточных реакций на стресс, которые передают сигналы опасности остальному организму для сохранения системного гомеостаза.172 Это означает, что дефекты множества механизмов, поддерживающих клеточную адаптацию к стрессу, могут способствовать гибели клеток, но в то же время могут поставить под угрозу способность умирающих клеток инициировать адаптивный иммунитет как следствие ограниченной адъювантности.

Основные иммуностимулирующие DAMP и цитокины, механистически связанные с ICD при раке

Макроаутофагия (здесь именуемая аутофагией) — это цитопротективный лизосомный путь деградации избыточного или потенциально опасного цитозольного материала и органелл.173–176 Убедительные доказательства указывают на то, что аутофагия необходима для сохранения лизосомальных запасов АТФ в ходе большинства (но не всех) вариантов МКБ.149 166 Как следствие клеточного пузыря, который опосредуется мембранным белком, ассоциированным с лизосомами 1. (LAMP1) и паннексин 1 (PANX1), АТФ высвобождается во внеклеточное пространство.165 177 В качестве альтернативы, связанное с МКБ высвобождение АТФ может происходить посредством антероградного транспорта ER-to-Golgi.178 Внеклеточный АТФ проявляет свою адъювантность путем связывания к пуринергическому рецептору P2Y2 (P2RY2), который способствует рекрутированию APC и их предшественников, и пуринергическому рецептору P2X7 (P2RX7), который способствует их активации и последующему высвобождению иммуностимулирующего цитокина интерлейкина (IL) -1β.149 150 179

Интегрированный стрессовый ответ (ISR), многоплановый молекулярный механизм для сохранения клеточного гомеостаза, необходим для воздействия шаперонов ER на клеточную поверхность во время МКБ.46 180–182 В частности, стресс ER, вызванный антрациклинами, стимулирует инактивирующие фосфорилирование эукариотической субъединицы фактора инициации трансляции 2 альфа (EIF2S1, наиболее известный как eIF2α) эукариотическим фактором инициации трансляции 2 альфа-киназой 3 (EIF2AK3, наиболее известный как PERK) 183, достигая высшей точки в белке 31, ассоциированном с CASP8- и В-клеточными рецепторами (BCAP31 ) -зависимая транслокация шаперонов ER к наружному листку плазматической мембраны.160 178 180 Для большинства индукторов ICD весь процесс также основан на антероградном транспорте ER-to-Golgi, опосредованном ассоциированным с пузырьками мембранным белком 1 (VAMP1) и ассоциированным с синаптосомами белком 25 (SNAP25) 53 180 184 и требует сопутствующей продукции ROS.71 Следует отметить, что связанное с ICD воздействие некоторых шаперонов ER (в частности, CALR) на клеточную поверхность, по-видимому, регулируется хемокиновым лигандом 8 (CXCL8) мотива CXC, 184 ER Ca ²⁺ уровней, 185 также как CASP2, длинные некодирующие РНК (например, ncRNA-RB1 и miR-27a) и интегрины плазматической мембраны, по крайней мере, в некоторых случаях.186–189 Воздействие на поверхность CALR (и других шаперонов ER) способствует поглощению умирающих клеток или их трупов APC, по крайней мере, в некоторых условиях при взаимодействии с белком 1, связанным с рецептором ЛПНП (LRP1) .178 190 Более того, воздействие CALR, по-видимому, способствует управляет секрецией IFN типа I с помощью APC, 191 192, что, как ожидается, также вносит вклад в иммуногенность RCD.

Механизмы сохранения клеточного гомеостаза в ответ на инфекцию также непосредственно участвуют в адъювантности ИКД, даже если последняя не управляется микробами.193 Действительно, множественные нуклеиновые кислоты эндогенного происхождения могут быть обнаружены с помощью PRR, чтобы инициировать передачу сигналов опасности, как правило, на основе эктопической локализации или структурных модификаций, которые возникают во время стрессовых реакций.135 Таким образом, управляемая химиотерапией ICD включает активацию TLR3 эндогенными видами РНК, приводя к секреции IFN типа I и последующему инициированию аутокринной петли, которая завершается высвобождением CXCL10158. Аналогично подобным линиям, раковые клетки поддаются ионизирующему излучению, поскольку они продуцируют IFN типа I ниже по ходу передачи сигналов CGAS, управляемых цитозольной дцДНК.194 195 Связываясь со своим родственным рецептором, IFN типа I опосредует сильные иммуностимулирующие эффекты как на APC, так и на эффекторные клетки.196 Он также запускает продукцию IFN-стимулированных генов (ISG), таких как CXCL10. Затем CXCL10 действует как хемоаттрактант для Т-клеток и вместе с CXCL1 и CCL2 для нейтрофилов, которые (по крайней мере, в некоторых условиях), по-видимому, способствуют управляемому ICD уничтожению остаточных раковых клеток антиген-независимым образом151, 158 Следует отметить, что нуклеиновые кислоты, полученные из раковых клеток, также могут опосредовать иммуностимулирующие эффекты, управляя секрецией IFN типа I в APC, как правило, при переносе внеклеточных микровезикул, содержащих нуклеиновую кислоту, между этими двумя клеточными компартментами.195 197

Точные реакции на стресс, связанные с высвобождением других ICD-ассоциированных DAMP, включая ANXA1 и HMGB1, еще предстоит полностью выяснить. Независимо от этого неизвестного, известно, что ANXA1 пространственно направляет APC к умирающим клеткам при взаимодействии с рецептором формилпептида 1 (FPR1), 157, в то время как HMGB1 может опосредовать надежные иммуностимулирующие функции путем передачи сигналов через специфический рецептор конечного продукта гликозилирования (AGER, также известный как RAGE) и TLR4,153 154 167 198–200 — активность, которая, по-видимому, зависит от состояния окисления.201 202 Более того, стало ясно, что молекулярный аппарат, участвующий в ICD-ассоциированной эмиссии DAMP, демонстрирует некоторую степень вариации в зависимости от индуктора ICD и типа клетки. Таким образом, воздействие CALR и секреция АТФ необходимы для полноценной иммуногенности раковых клеток, уступающих ФДТ на основе гиперицина, но это может происходить независимо от фосфорилирования eIF2α и активации аутофагии. АТФ и HMGB1, но CALR экспонируется на плазматической мембране на низких уровнях, и активация ISR, по-видимому, не требуется.59 204

Критическая роль передачи сигналов DAMP в иммуногенности RCD была установлена ​​множеством дополнительных механистических экспериментов, направленных на: (1) фармакологическое или генетическое ингибирование сигнальных путей, участвующих в высвобождении DAMP (например, с раковыми клетками, экспрессирующими нефосфорилируемый вариант eIF2α) 180; (2) искусственная активация стрессовых ответов, ответственных за выброс DAMP (например, со стрессорами ER в неопластических клетках, подвергающихся варианту RCD, иначе не связанного с активацией ISR) 205 206; (3) нокаут или нокдаун генов, кодирующих DAMP (например, в раковых клетках, лишенных HMGB1 за счет РНК-интерференции) 23 153; (4) нейтрализация / блокада DAMP (например, клетками, сверхэкспрессирующими внутриклеточный фермент, разрушающий цитозольную дцДНК) 194; (5) экзогенная комплементация DAMP (например, с рекомбинантным CALR, вводимым в клетки, подвергающиеся RCD в отсутствие воздействия CALR) 22 180 207 208; (6) усиление антагонистических процессов (например, раковых клеток, сверхэкспрессирующих антифагоцитарную молекулу CD47) 209 210; (7) блокада рецепторов DAMP (например, с помощью моноклональных антител, специфичных для рецепторов IFN типа I) 158 и (8) нокаут или нокдаун генов, кодирующих рецепторы DAMP в хозяине (например, с помощью Fpr1 ^{— / —} мышей).157 Несколько линий клинических данных также предполагают, что умелая сигнализация об опасности имеет решающее значение для онкологических больных для получения клинической пользы от терапии, индуцирующей ИКД.211 Эти результаты обычно относятся к прогностической или прогностической ценности (1) активации стрессовых реакций, влияющих на выброс DAMP. в раковых клетках (например, фосфорилирование eIF2α в сочетании с высокими уровнями CALR в биоптатах пациентов с немелкоклеточным раком легкого) 212; (2) уровни экспрессии специфических DAMP (например, уровни HMGB1 в биоптатах пациентов с раком груди, подвергшихся адъювантной химиотерапии на основе антрациклинов) 213 214; (3) Эмиссия DAMP раковыми клетками (например, воздействие CALR на бласты у пациентов с острым миелоидным лейкозом) 215 216; (4) фактическая передача сигналов опасности в TME (например, генные сигнатуры передачи сигналов IFN типа I у субъектов с раком груди) 217; (5) полиморфизм потери функции в генах, кодирующих рецепторы DAMP (например, P2R × 7 , TLR4 и FPR1 полиморфизмов у пациентов с карциномой груди, получающих неоадъювантные антрациклины) 23 150 153 157 и (6) уровни экспрессии антагонистов DAMP (например, экспрессия CD47 на раковых клетках у пациентов с острым миелоидным лейкозом, плоскоклеточный рак пищевода и светлоклеточный рак яичников).218–220 Это лишь несколько примеров, подтверждающих важность передачи сигналов DAMP для того, чтобы RCD воспринимался как иммуногенный у пациентов.

Факторы микросреды, влияющие на МКБ

Хотя некоторые ткани реагируют на патогенную инфекцию более устойчиво, чем другие (что отражает различную численность резидентных в тканях APC), клетки, погибающие от микробной инфекции, обычно вызывают адаптивный иммунитет независимо от анатомического расположения221. гибели раковых клеток является основным фактором, определяющим их способность инициировать адаптивные иммунные ответы, даже при наличии достаточной антигенности и адъювантности, 5 222, и это имеет большое значение для выбора экспериментальных моделей для оценки ICD in vivo (см. In vivo модели ).

Существует несколько механизмов, посредством которых микросреда развивающихся опухолей может противодействовать инициированию или выполнению ICD, в значительной степени отражая способность различных новообразований устанавливать периферическую толерантность. Так называемые «холодные» и «исключенные» опухоли плохо инфильтрируются иммунными клетками, включая APC и их предшественники, на исходном уровне, что означает, что вероятность продуктивной обработки умирающих раковых клеток и их трупов и их перекрестного прайминга снижается. Прайминг также ограничивается коингибиторными рецепторами, экспрессируемыми Т-клетками, инфильтрирующими опухоль, включая CTL-ассоциированный белок 4 (CTLA4) и клеточный рецептор 2 вируса гепатита А (HAVCR2, наиболее известный как TIM-3), гликопротеин, который связывается с HMGB1, а также сигнал «съешь меня» — фосфатидилсерин на поверхности умирающих клеток.152 225

Более того, активность APC, инфильтрирующих злокачественные образования, обычно ингибируется иммуносупрессивными цитокинами, включая (но не ограничиваясь) IL-10 и трансформирующий фактор роста бета 1 (TGFB1) .226 227 Эти биологически активные факторы в большом количестве вырабатываются в ответ на гипоксию. и во время хронического воспаления, и надежно связаны с иммуноэвазией и прогрессированием опухоли.228 IL-10 и TGFB1 секретируются раковыми клетками и иммуносупрессивными иммунными клетками, активно рекрутируемыми в TME, такими как CD4 ⁺ CD25 ⁺ FOXP3 ⁺ регуляторных T (T _REG ) клеток, M2-поляризованных опухоль-ассоциированных макрофагов (TAM) и / или супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC).229–231 Важно отметить, что эти популяции иммунных клеток экспрессируют высокие уровни эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазы 1 (ENTPD1, ​​наиболее известная как CD39) и экто 5′-нуклеотидазы (NT5E, наиболее известная как CD73), 232–234 двух ферментов, которые взаимодействуют для преобразования внеклеточных АТФ в аденозин, который также обеспечивает устойчивые иммуносупрессивные эффекты. 235 Таким образом, клетки T _REG , M2-поляризованные ТАМ и MDSC также оказывают прямое антагонистическое действие на ICD.

Редокс-статус TME и отдельных DAMP или их рецепторов также может влиять на способность RCD управлять адаптивным противораковым иммунитетом.Например, высвобождение окисленного HMGB1 раковыми клетками, подвергающимися пироптозу, гассдермин-зависимой форме RCD, обычно связанной с активацией инфламмасом, 1 ограничивает противораковый иммунитет, поскольку он способствует экспрессии коингибиторных лигандов.236 Напротив, окисленная митохондриальная ДНК способствует активации инфламмасом. и, следовательно, секреция иммуностимулирующих факторов, таких как IL-1β, в TME, 237 хотя фактическое патологическое значение этого пути остается неизвестным.

Другой важный механизм прогрессирования опухолей, позволяющий избежать ИКД на этапе выполнения (т.е. способность ЦТЛ, управляемых ИКД, опосредовать цитотоксические эффекты), зависит от иммунного истощения, то есть установления дисфункции Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль.238–241 Коингибирующие рецепторы, включая запрограммированную гибель клеток 1 (PDCD1, также известный как PD-1), являются основными (но не единственными) участниками в этой обстановке. Действительно, активированные CTL имеют повышенные метаболические потребности, и как глюкоза, так и аминокислоты обычно ограничены в TME.242 243 Более того, некоторые иммуносупрессивные метаболиты, которые обогащены TME, помимо аденозина, такие как кинуренин и лактат, 244 245 и цитокин-зависимые. иммуносупрессия также действует на CTL.224 246 247 Наконец, сосудистые дефекты и реакция плотной стромы, которые характерны для некоторых опухолей (например, рака поджелудочной железы), могут составлять физический барьер для инфильтрации опухоли CTL, перекрестно праймированных в лимфатических узлах, дренирующих опухоль, 248 249 де-факто препятствует выполнению этапа ICD.Помимо иллюстрации критической важности местного микроокружения для иммуногенности RCD, эти наблюдения объясняют, почему одни и те же раковые клетки, получающие одни и те же индукторы ICD in vitro и in vivo, могут различаться по своей способности инициировать адаптивный иммунитет.

Важно отметить, что несколько терапевтических средств, индуцирующих ИКД, а также различные методы лечения, не способствующие развитию ИКД, могут опосредовать иммуномодулирующие эффекты на TME, напрямую взаимодействуя с популяциями иммунных клеток (а не с раковыми клетками).73 Хотя такие иммуномодулирующие эффекты важны для максимальной эффективности терапии у пациентов, они концептуально и механистически не связаны с индукцией ИКД и поэтому не будут здесь обсуждаться далее.

Выявление МКБ при раке

За последние два десятилетия интенсивная волна исследований раскрыла основные механистические и корреляционные аспекты МКБ как процесса, кульминацией которого является активация адаптивного иммунитета против умирающих клеток. Экспериментальные стратегии, разработанные для оценки иммуногенности RCD, включают: (1) исследование эмиссии DAMP умирающими клетками (и активации соответствующих стрессовых реакций в); (2) биохимические и функциональные тесты для оценки активации APC и их способности опосредовать перекрестное праймирование in vitro и (3) способность умирающих клеток инициировать адаптивный иммунитет in vivo у иммунокомпетентных сингенных хозяев.Здесь мы кратко изложим современные методы оценки ICD в онкологических условиях.

Анализы in vitro с раковыми клетками

Надежные экспериментальные данные показывают, что способность RCD стимулировать адаптивный иммунитет критически зависит от прогрессирующего (но не исчерпанного) ответа CTL.121 Предположительно, это отражает необходимость наличия одного или нескольких TNA / TAA выше определенного порога в сочетании со своевременной доставкой сигналов опасности (которые, вероятно, будут варьироваться в зависимости от индуктора RCD и типа опухолевых клеток).Таким образом, в то время как раковые клетки мыши, подвергшиеся воздействию сердечных гликозидов, выделяют ICD-ассоциированные DAMP, они не могут инициировать защитный противораковый иммунитет после прививки иммунокомпетентным сингенным хозяевам, поскольку цитотоксичность ограничена и опухоли развиваются в местах вакцинации250. быстрая гибель клеток сочетается с массивным высвобождением TNA / TAA, но раковые клетки мыши, подвергнутые этой жесткой процедуре, не могут быть использованы для защиты сингенных иммунокомпетентных хозяев от последующего заражения живыми клетками того же типа, скорее всего, из-за неоптимальной адъювантности.20 59 Цитотоксический ответ, вызываемый индукторами ИКД, классически оценивался по биомаркерам терминальной гибели клеток, таким как проницаемость плазматической мембраны, а также по обычным биомаркерам апоптоза, включая воздействие фосфатидилсерина, диссипацию митохондриального трансмембранного потенциала и активацию инициатора или эффектора каспазы148 Обоснование и принципы этих анализов были подробно описаны нами и другими, 58 251 252 и, следовательно, не будут здесь обсуждаться далее. Тем не менее, существование вариантов ICD, основанных на некроптозном аппарате и / или возникающих независимо от активации каспаз1 59, 61, указывает на потребность в инструментах для измерения индукции ICD, которые могут учитывать все потенциально важные пути RCD.

Внутриклеточные реакции на стресс, механически участвующий в высвобождении DAMP, также использовались в качестве суррогатных биомаркеров ICD. Активация ISR обычно отслеживается в трех его ретикулярных компонентах путем оценки фосфорилирования eIF2α, сплайсинга X-box-связывающего белка 1 (XBP1) и активации транслокации ядер транскрипционного фактора 6 (ATF6), в некоторых случаях вместе с белками теплового шока семейства A ( Hsp70) член 5 (HSPA5, также известный как GRP78) активная регуляция. Эти биомаркеры обнаруживаются с помощью иммуноблоттинга, проточной цитометрии, иммунофлуоресцентной микроскопии, иммуногистохимии и / или ОТ-ПЦР с использованием специальных антител или зондов.33 183 253 Связанная с ICD активация PRR в раковых клетках классически измерялась иммуноблоттингом с антителами, специфичными для ключевых фосфорилированных трансдукторов, таких как фосфорилированный регуляторный фактор 3 IFN (IRF3) ниже передачи сигналов CGAS, 254 255 или с помощью люминесцентных репортеров на основе транскрипции. 254 256–258 В качестве альтернативного подхода отслеживалось эктопическое накопление нуклеиновых кислот, как правило, с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии со специальными антителами или путем субклеточного фракционирования в сочетании с необязательным ферментативным расщеплением нуклеиновых кислот и количественным определением на основе поглощения.158 256 Активация аутофагии в клетках, подвергшихся действию потенциальных индукторов ИКД, в значительной степени отслеживалась сопутствующей оценкой липидирования легкой цепи 3 белка 1, ассоциированного с микротрубочками (MAP1LC3, наиболее известный как LC3) и деградации аутофагического субстрата, такого как секвестосома 1 (SQSTM1, также известный как p62) с помощью иммуноблоттинга в контексте соответствующих контрольных условий.259 Аутофагия действительно является динамическим процессом, и простой анализ липидирования LC3 в клетках, отвечающих на стрессовые условия, не может быть использован для различения между активацией аутофагии и ингибированием.259

Экспозиция на клеточной поверхности шаперонов ER в качестве суррогатного биомаркера ICD может быть определена (1) проточной цитометрией в непроницаемых клетках раннего апоптоза с использованием специфических антител или специальных конструкций (например, CALR, слитого с HaloTag) в сочетании с жизненно важными красителями, такими как 7-аминоактиномицин D (7-AAD), 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или иодид пропидия (PI), которые позволяют исключить мертвые клетки из анализа41 180 205 260; (2) флуоресцентная микроскопия в клетках, фиксированных низкой концентрацией параформальдегида, а затем иммуноокрашенных антителами, специфичными для шаперонов ER21 32 43 160 261; (3) флуоресцентная микроскопия или видеомикроскопия в клетках, конститутивно экспрессирующих конструкцию, в которой выбранный шаперон ER слит с GFP или другой флуоресцентной меткой 33 205 250 262 и (4) иммуноблоттинг в клетках, ранее подвергнутых биотинилированию белков клеточной поверхности с последующим путем осаждения, опосредованного стрептавидином.160 263

Два основных подхода были использованы для определения высвобождения растворимых DAMP, связанных с ICD, и цитокинов из умирающих клеток: (1) количественное определение DAMP / цитокинов в культуральных супернатантах и ​​(2) количественное определение остаточных DAMP / цитокинов во внутриклеточном микроокружении. Следует отметить, что, хотя первый подход универсален, последний не может быть использован для DAMP и цитокинов, которые активно синтезируются перед высвобождением, таких как IFN типа I и CXCL10.148 Таким образом, внеклеточный и внутриклеточный АТФ можно количественно оценить с помощью коммерческой люминесценции. анализы супернатантов культур и клеточных лизатов соответственно.149 150 178 264 Внеклеточный АТФ и продукты его распада (АДФ, АМФ и аденозин) также можно количественно определить с помощью целевой масс-спектрометрии, 149 в то время как его внутриклеточный аналог можно контролировать с помощью проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии на окрашивание АТФ-специфическим красителем хинакрином или реализация репортеров на основе АТФ-специфического флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). 165 265 Наконец, секреция ANXA1, HMGB1, IFN типа I и CXCL10 клетками, подвергающимися RCD, классически контролировалась коммерческим ELISA или иммуноблоттингом на супернатантах культур или клеточных лизатах.32 151 153 157 158 266 Кроме того, доступна флуоресцентная версия HGMB1, которая позволяет оценить высвобождение HMGB1 с помощью флуоресцентной микроскопии или видеомикроскопии в зависимости от остаточной флуоресценции клеток. 33 42 250 267 Следует отметить, что обычно применяется ОТ-ПЦР. используемый для мониторинга IFN типа I и CXCL10,158 268, этот подход де-факто измеряет передачу сигналов PRR, поскольку транскрипция не обязательно связана с трансляцией и секрецией.

Анализы in vitro с иммунными клетками

В то время как внутриклеточные реакции на стресс и выброс DAMP можно одинаково контролировать на моделях опухолей у мышей и человека, исследования in vivo в настоящее время можно проводить только в первых (см. In vivo модели ).Чтобы частично обойти эту проблему и дать возможность функциональной оценки иммуногенности RCD как в системе мыши, так и в организме человека, специалисты в этой области позаимствовали несколько классических анализов из иммунологии. В целом, эти эксперименты направлены на оценку того, могут ли умирающие раковые клетки стимулировать способность APC оптимально перекрестно праймировать CTL и, следовательно, инициировать адаптивный иммунный ответ.

В частности, APC человека или мыши, подвергнутые воздействию умирающих раковых клеток человека или мыши, соответственно, часто исследуются на предмет: (1) их способности поглощать умирающие клетки или их трупы; (2) их статус созревания и миграционная способность и (3) их способность перекрестно презентировать антигенный материал CTL.Фагоцитоз часто оценивают путем совместного культивирования APC или их предшественников и умирающих раковых клеток при индивидуальной предварительной маркировке обоих отделов различными нетоксичными флуоресцентными красителями, которые остаются в цитоплазме, такими как сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE) или PKh36, с последующей флуоресцентной микроскопией или проточной микроскопией. цитометрия.32 269 270 В качестве альтернативы предварительно метят только раковые клетки, а фагоцитоз отслеживают при окрашивании сокультуры моноклональными антителами, специфичными для выбранных APC.264 266 Кроме того, поглощение апоптозными клетками было измерено путем внутривенного введения предварительно меченых умирающих раковых клеток мыши с последующим выделением спленоцитов и проточной цитометрией. 268 270 Статус созревания APC классически измеряли с помощью проточной цитометрии при окрашивании сокультуры клеток с помощью антитела, специфичные к молекулам MHC класса II и костимулирующим молекулам, включая CD80, CD83 и CD86 (все они активируются во время созревания) .21 43 263 271 В качестве альтернативного или дополнительного подхода функциональное созревание контролировалось путем обнаружения цитокинов, секретируемых в культуральных супернатантах. посредством APC, приобретающих иммуностимулирующий фенотип, включая (но не ограничиваясь) IL-1β, IL-6, IL-12 и IL-23.41 150 263 ELISA и проточная цитометрия по внутриклеточному окрашиванию специальными антителами остаются методами выбора для последней стратегии. Тем не менее, для внутриклеточной оценки IL-1β требуется антитело, направленное против полностью зрелого варианта белка, поскольку его предшественник не секретируется.272 273 Была оценена миграционная способность (которая отражает способность умирающих клеток секретировать хемотаксические факторы). с помощью тестов Transwell 274–275 или с помощью специальных микрофлюидных устройств, которые позволяют проводить видеомикроскопию (если клетки предварительно помечены флуоресцентными красителями).157 276

Потенциал перекрестного прайминга APC, подвергнутых воздействию раковых клеток, подвергающихся RCD, чаще всего оценивался путем совместного культивирования с сингенными, наивными Т-клетками с последующей оценкой: (1) пролиферативного ответа Т-клеток, как правило, с помощью проточной цитометрии на предыдущем этапе. маркировка CFSE271 277; (2) статус активации Т-клеток, чаще всего с помощью проточной цитометрии при окрашивании моноклональными антителами, специфичными для поверхностных белков, связанных с активацией (например, CD69, LAMP1, PD-1) 150 153 278; (3) Функциональный профиль Т-клеток, либо с помощью проточной цитометрии при внутриклеточном окрашивании моноклональными антителами, специфичными для эффекторных молекул, таких как IFN-γ, перфорин 1 (PRF1) и гранзим B (GZMB), либо путем количественного определения внеклеточного IFN-γ с помощью ELISPOT.21 41268 278 Наконец, функции цитотоксических Т-клеток при перекрестном праймировании могут быть проверены путем измерения лизиса живых раковых клеток того же типа, что и для пульсации APC 46 279 280 или путем анализа ответа на специфические TAA 281 282

Модели in vivo

В настоящее время доступно лишь несколько моделей для исследования ICD in vivo (рисунок 2). Подход «золотой стандарт» для оценки способности умирающих клеток инициировать адаптивный иммунитет включает тесты вакцинации на иммунокомпетентных сингенных мышах.148 В этом контексте раковые клетки мыши подвергаются действию потенциального индуктора МКБ in vitro и затем вводятся в качестве вакцины sc . В отсутствие какого-либо иммунологического адъюванта и после удаления экзогенных химических образований (если таковые имеются, таких как Сам индуктор ICD). Через одну-две недели мышей заражают s.c . с живыми раковыми клетками того же типа (в минимальной дозе, которая на 100% эффективна для создания прогрессирующих поражений у наивных мышей) и наблюдали в течение 40–60 дней для выявления случаев и роста опухоли.20 22 153 178 208 Не только процент мышей без опухолей, но и скорость роста опухолей, потенциально развивающихся, несмотря на индуцированный вакциной адаптивный иммунный ответ, обычно используются в качестве индикаторов (по крайней мере, некоторой) степени иммуногенности. Специфичность подтверждается повторным заражением мышей без опухолей в конце эксперимента другой линией сингенных раковых клеток, которая, как ожидается, будет вызывать прогрессирующие неопластические поражения у 100% мышей. Следует отметить, что вакцинацию также можно проводить с помощью APC, подвергнутых воздействию умирающих раковых клеток in vitro, или проводить в терапевтических (а не профилактических) условиях, то есть как лечение установленных опухолей.157 283–285 Более того, CD8 ⁺ Т-клетки, перекрестно праймированные in vitro APC, подвергнутыми воздействию раковых клеток, подвергающихся ICD, были использованы в экспериментах по адаптивному переносу для лечения опухолей, ранее созданных с помощью живых раковых клеток того же типа32 286. сравнение эффективности любого индуктора RCD против раковых клеток мышей, растущих у иммунокомпетентных, сингенных и иммунодефицитных мышей, может дать намек на способность такого вмешательства управлять ICD (в таком случае терапевтическая эффективность будет ограничена у иммунодефицитных хозяев).Однако эта последняя экспериментальная установка по сути не подходит для различения между индукцией ИКД и иммуностимуляцией, не связанной с ИКД (см. Интерпретация МКБ ).

Современные методы оценки МКБ in vivo в онкологических условиях. Современные модели для определения способности умирающих раковых клеток вызывать адаптивный, опухолеспецифический иммунный ответ in vivo неизменно полагаются на опухоли мышей, установленные у иммунокомпетентных сингенных хозяев. В моделях профилактики раковые клетки мышей, гибнущие in vitro от потенциального индуктора иммуногенной клеточной смерти (ICD), используются в качестве вакцины либо как таковые, либо при нагрузке на незрелые сингенные дендритные клетки (DC).Способность мышей отклонять (заболеваемость опухолью) или контролировать (рост опухоли) повторное испытание живыми раковыми клетками того же типа, инокулированными через 1-2 недели, отслеживают как признак защитного противоракового иммунитета. В терапевтических условиях опухоли мышей, развивающиеся у иммунокомпетентных сингенных хозяев, обрабатывают аутологичными DC, предварительно загруженными раковыми клетками, подвергнутыми воздействию потенциального индуктора ICD in vitro (обычно в сочетании с иммунологическими адъювантами), или аутологичными цитотоксическими лимфоцитами CD8 ⁺ , примированными in vitro посредством те же DC (обычно в комбинации с IL-2 или другими цитокинами, поддерживающими экспансию in vivo).Контроль над опухолью и выживаемость мышей отслеживают как индикаторы терапевтического противоракового иммунитета. В моделях скрытого рака мышиные раковые клетки используются для образования поражений в отдаленных анатомических участках (либо искусственно, либо с использованием естественной способности некоторых клеточных линий генерировать метастазы) с последующим лечением только на одном участке заболевания (как правило, в контексте неактивных в остальном случаев). системная иммуностимуляция). Контроль опухоли на необработанном участке заболевания и выживаемость мышей отслеживают как признаки системного противоопухолевого иммунитета, имеющего терапевтическое значение.Наконец, в внутричерепных / экстракраниальных моделях раковые клетки мыши используются для образования одной внутричерепной и одной экстракраниальной опухоли, только одна из которых получает лечение (обычно системным агентом, который не может преодолеть гематоэнцефалический барьер [BBB] для экстракраниального поражения, или лучевая терапия при внутричерепных поражениях в обоих случаях в комбинации с неактивными иммуностимуляторами). Как и в моделях абскопа, контроль опухоли в необработанном месте заболевания и выживаемость мышей отслеживают как индикаторы терапевтического противоракового иммунитета с системным охватом.Во всех этих моделях мышей, достигающих системного, длительного искоренения болезни, часто повторно проверяют на раковые клетки для мониторинга устойчивости (с теми же раковыми клетками, которые используются для установления болезни) и специфичности (с неродственными, но сингенными раковыми клетками). МКБ — иммуногенная клеточная смерть; IL-2, интерлейкин 2.

Три альтернативных подхода к оценке ICD in vivo в иммунокомпетентных сингенных системах критически зависят от измерения роста опухоли на необработанных участках заболевания, что означает, что они могут быть реализованы только с помощью локализованных методов лечения (например, , очаговое ионизирующее излучение и внутриопухолевая доставка терапевтических агентов, которые не могут достичь активных концентраций системно) 79 287–289 или когда необработанный участок биологически недоступен для лечения, но доступен для CTL (например, метастазы в мозг в организме хозяина, получающего химиотерапевтические препараты, не преодолевать гематоэнцефалический барьер).290 Модели так называемой «абсопальной реакции», то есть регрессии поражения вне поля у пациентов, получавших ионизирующее излучение, в удаленное место болезни 291 оказались очень полезными в этой ситуации. Обычно иммунокомпетентным мышам прививают либо (1) раковые клетки для образования двух слегка асинхронных повреждений s.c ., В анатомически удаленных местах, либо (2) склонные к метастазированию раковые клетки для образования пальпируемого поражения s.c . и метастатическое (легкое) распространение.79 288 292 В обоих сценариях только одно из подкожных поражений получает ионизирующее излучение (как правило, в присутствии иммуностимулирующей молекулы, не имеющей системного эффекта от одного агента) и ответ необлученного поражения, метастатической нагрузки и общая выживаемость контролируется как индикаторы индукции ICD в сочетании с активацией адаптивного иммунитета с системным охватом.78 79 287 288 292 293 Мышей, отвергающих облученные и необлученные поражения, можно повторно подвергнуть испытанию через 30-40 дней после искоренения заболевания теми же раковыми клетками, которые использовались первоначально. для оценки долговечности защиты, а также с сингенными раковыми клетками другого типа для контроля ее специфичности.49 292 293 Аналогичным образом, различные типы клеток могут использоваться для образования первичных и вторичных поражений, чтобы подтвердить, что эффект вакцинации in situ, создаваемый ICD, является антиген-специфичным.294 Наконец, модели одновременного внутричерепного и экстракраниального заболевания были использованы для мониторинга способность системных химиотерапевтических агентов, которые не могут проникать через гематоэнцефалический барьер и фокусное ионизирующее излучение, вызывать противоопухолевый иммунитет на периферии.295 Следует отметить, что в этих последних моделях наличие экстракраниальных поражений увеличивает эффективность иммунотерапии против краниальных новообразований за счет стимулирование транспорта CTL, 296 хотя актуальность этого явления для иммунитета, управляемого ICD, еще предстоит выяснить.

Все эти модели подходят для исследований ex vivo, направленных на: (1) характеристику DAMPs, выделяемых раковыми клетками, реагирующими на стресс in situ; (2) иммунологическое профилирование APC и CTL, лежащих в основе инициирования и реализации противоопухолевого иммунитета in vivo, и (3) идентификация механистических и коррелятивных аспектов ICD, вызванных in vivo выбранным стрессором (ами) (например, с истощением, стратегии блокировки или нейтрализации) .79 287 288 293

Интерпретация МКБ

Большинство анализов, доступных в настоящее время для оценки склонности RCD к управлению адаптивными иммунными ответами, не учитывают должным образом сложность, присущую МКБ, которая (как подробно описано выше) в конечном итоге представляет собой весьма серьезную проблему. контекстуальный процесс, который зависит от (1) инициирующего стимула, (2) отвечающей клетки и (3) хозяина (рисунок 1).В этом контексте интерпретация анализов, связанных с ИКД, сталкивается с рядом проблем, которые всегда следует учитывать.

Суррогатные биомаркеры ИКД, такие как накопление цитозольной ДНК, воздействие шаперонов ER на поверхности клетки или высвобождение АТФ и / или HMGB1 умирающими клетками, а также биомаркеры стрессовых реакций, лежащих в основе их выброса, сыграли важную роль в характеристике ключевых молекулярных игроков процесса и идентификации потенциальных индукторов ИКД в больших усилиях по скринингу.183 184 262 Однако не все триггеры ИКД действуют через одни и те же молекулярные механизмы, о чем свидетельствует способность ФДТ на основе гиперицина инициировать противоопухолевый иммунитет независимо от аутофагической способности злокачественных клеток.203 Более того, эмиссия связанных с ИКД DAMPs в соответствии с правильным пространственно-временным паттерном требуется, но недостаточно, чтобы APC инициировали CTL-зависимые иммунные ответы против умирающих клеток. Таким образом, сердечные гликозиды вызывают многоплановую стрессовую реакцию, достигающую кульминации со всеми основными суррогатными биомаркерами ИКБ, и все же не могут установить защитный иммунитет в тестах на вакцинацию золотого стандарта.250 Эти наблюдения предполагают, что способность любого стрессора управлять вариантом RCD, связанным с адаптивным иммунитетом, не может быть экстраполирована с помощью анализов in vitro, направленных на раковые клетки.

Хотя их масштабируемость для скрининговых приложений ограничена, иммунологические анализы, проверяющие способность APC, примированных умирающими клетками, участвовать в последовательном процессе, ведущем к перекрестному праймингу (что является абсолютным требованием для адаптивного иммунитета в этих условиях), очевидно, предлагают больше точная оценка иммуногенности RCD.Однако эти анализы также по своей сути ограничены тем, что они неспособны оценить две основные предпосылки для перекрестного прайминга: (1) способность APC физически достигать сайтов RCD и (2) наличие наивных клонов Т-клеток, специфичных для антигенов. экспрессируется умирающими клетками, что в конечном итоге требует проверки на моделях in vivo.

Анализы вакцинации оказались очень полезными для демонстрации того, что сингенные умирающие клетки могут управлять адаптивным иммунитетом в присутствии адекватной антигенности и адъювантности.20 22 153 178 208 297 Однако использование не опухолевых хозяев обеспечивает очень высокую степень чувствительности, что не обязательно может быть выгодным, если конечной целью является клиническое применение. В этом контексте абскопальные и внутричерепные / экстракраниальные модели могут иметь повышенную патофизиологическую значимость, поскольку (с ограничениями, описанными выше) они имитируют установленное метастатическое заболевание у людей. Однако эти модели ограничены тем, что они могут измерять только системный иммунитет к местным методам лечения или агентам, которые не проникают через гематоэнцефалический барьер.79 288 Более того, в значительной степени отражая клинический сценарий, выявление системного иммунитета с потенциалом к ​​искоренению заболевания в этих моделях является сложной задачей и часто требует предоставления дополнительных иммуностимулирующих сигналов, которые противодействуют периферической толерантности.77–79 Такая ограниченная чувствительность (хотя клинически значима). может быть вредным на ранних этапах открытия, когда оптимальные условия ICD еще не определены.

Как группа, модели in vivo, относящиеся к МКБ, подвержены множеству проблем, включая тот факт, что можно исследовать только мышиные системы, и нельзя исключать, что молекулы и популяции клеток, действующие в условиях человека, могут быть разными (при хотя бы до некоторой степени).298 299 Более того, все современные модели для обнаружения ICD in vivo полагаются на установление первичных поражений с помощью линий мышиных раковых клеток, которые (1) были иммуноотредактированы и приобрели способность уклоняться от иммунного надзора у своего первоначального хозяина (подразумевая, что они не воспроизводят должным образом первичный онкогенез), (2) имеют относительно низкую и однородную мутационную нагрузку по сравнению с человеческим заболеванием (и, следовательно, не могут воспроизвести мутационный и антигенный ландшафт опухолей человека), (3) обычно не создают сложного стромального и эндотелиального архитектура как следствие их повышенной скорости пролиферации (которая отличается от человеческих новообразований) и (4) имплантируются путем инъекции, которая сама по себе может опосредовать, по крайней мере, некоторую степень иммуностимуляции.300–303 Наконец, потребность в полностью сингенных настройках (для предотвращения отторжения на основе несоответствия HLA) значительно ограничивает спектр клеточных линий и штаммов грызунов, которые могут быть использованы для этой цели, с преобладанием моделей, основанных на C57BL / 6 или BALB / c фон.304

Текущие попытки обойти, по крайней мере частично, эти проблемы включают использование ортотопических моделей (которые предлагают улучшенные характеристики микросреды), моделей, управляемых трансгенами (которые могут предложить лучшее представление о раннем онкогенезе) и моделей, управляемых канцерогенами (которые имеют превосходную неоднородность).305–307 Однако не все эти системы совместимы с вакцинацией и / или анализами скрытого диагноза, подразумевая, что индукция ИКД может быть неточно решена только путем дополнения наблюдений in vitro терапевтической эффективностью у иммунокомпетентных по сравнению с иммунодефицитными животными. Более того, значительные усилия прилагаются к созданию гуманизированных мышей, что в конечном итоге может позволить оценить индукцию ИКД in vivo с человеческими раковыми клетками.308–310 Чаще всего эти модели включают приживление функциональных иммунных клеток человека из различных источников в организм человека. мышей с высоким иммунодефицитом как средство (частичного и временного) восстановления функциональной иммунной системы человека.304 Основные ограничения этого подхода (которые различаются по степени тяжести в зависимости от точного протокола эксперимента) включают: (1) способность иммунных клеток человека реагировать против своих собратьев мыши из-за межвидовой несовместимости и, как следствие, болезни трансплантат против хозяина311 312; (2) ограниченная способность (по крайней мере, некоторых) цитокинов мыши поддерживать восстановление иммунных клеток и функционировать через рецепторы цитокинов человека313; (3) плохо изученная до сих пор перекрестная связь между остаточными компонентами иммунной системы мыши (например, макрофагами, гранулоцитами, эндотелиальными клетками) и восстановленными клетками человека309 и (4) отсутствие селекции тимуса.314 Хотя усовершенствованные стратегии для обхода этих проблем изучаются, включая использование мышей, сконструированных для экспрессии цитокинов человека, а также коимплантацию фрагментов тимуса 313, 315–320, эта технология до сих пор является незрелой для оценки ICD в организме человека.

Таким образом, оценка ICD требует экспериментальной поддержки со стороны различных анализов in vitro и in vivo, которые должны кумулятивно оценить способность злокачественных клеток, подвергающихся RCD в естественном анатомическом местоположении, рекрутировать APC и стимулировать их для инициирования адаптивного противоракового иммунитета.

Выводы и перспективы

Накапливающиеся данные демонстрируют, что начало ИКД имеет решающее значение для устранения инфекционных патогенов и выделяется как основная терапевтическая цель терапии рака, особенно с учетом текущего клинического успеха ИКБ321 322 Действительно, способность нескольких агентов управлять ICD в онкологических условиях затрудняется надежными иммуносупрессивными схемами, установленными в TME во время совместной эволюции опухоль-хозяин, и ICB могут быть инструментами для инактивации таких схем.56 77 79 323 324

Есть три основных препятствия, мешающих реализовать полный клинический потенциал индукторов ИКД. Во-первых, большинство этих агентов были разработаны клинически на основе парадигмы максимально переносимой дозы (МПД), и теперь ясно, что повышенная цитотоксичность не обязательно совпадает с оптимальной иммуногенностью.194 Более того, подавляющее большинство клинически используемых индукторов ИКД имеют были разработаны доклинически на иммунодефицитных моделях болезни, что подразумевает, что мало что известно об их влиянии на иммунную систему хозяина.299 302 Во-вторых, несмотря на значительный прогресс за последние два десятилетия, наше понимание RCD-ассоциированной передачи сигналов DAMP остается ограниченным. В частности, ограниченное внимание было уделено изучению иммуносупрессивных DAMP, включая (но не ограничиваясь ими) фосфатидилсерин, простагландин E ₂ и аденозин, особенно в контексте ICD.68 325–327 Интересно, что MAMP также могут быть иммуносупрессивные, и они важны для установления симбиоза.328 Влияние метаболизма, 329 кишечной микробиоты330 и центральной нервной системы331 на высвобождение и активность DAMPs также еще предстоит выяснить.Наконец, ключевая роль хозяина в обнаружении ICD в основном изучалась с точки зрения адъювантности, то есть связанной со способностью хозяина декодировать передачу сигналов DAMP через PRR5. И наоборот, мало что известно о репертуаре TCR хозяев, которые реагируют на ICD с устойчивым адаптивным иммунитетом по сравнению с хозяевами, которые этого не делают, и о влиянии факторов окружающей среды и поведения (например, микробиома, диетических привычек, стресса) на определение ICD у хозяина.

Наряду с созданием гуманизированных моделей грызунов, которые позволяют исследовать МКБ in vivo (хотя и с оговорками, связанными с микросредой мышей), мы считаем, что эти проблемы в настоящее время являются основными проблемами в ближайшем будущем.Мы предполагаем, что клиническая эффективность многочисленных агентов, используемых в настоящее время для лечения рака, может быть значительно повышена, если мы получим возможность использовать их в качестве индукторов ИКД. Новые технологии постоянно улучшают нашу способность контролировать иммунологические изменения, происходящие у пациентов, реагирующих на индукторы ИКД, включая изменения во внутриопухолевом и циркулирующем репертуаре TCR332. В целом, настало время принять вызов и реализовать клинический потенциал индукторов ИКД. и улучшить исход заболевания для различных онкологических больных.

данных до высокого определения. Кроссовер esterno QX70

Nuovo кроссовер Infiniti QX30 — это большая база. La prima del modello è avvenuta alla fine dell’autunno 2015 e le vendite sul mercato russo sono iniziate il 1 ° settembre 2016.

Inffect, l’Infiniti QX30 не является большим разнообразием dalla berlina Q30 и может быть ужасным, что и семплицовый унаследовал модификацию incrociata.

Эстерно

Вероятно, главное преимущество последнего пикколо-кроссовера премиум-класса Nissan — это асфальт.Верно, это последняя версия модели для тех, кто любит дизайн Aziendale Infiniti. Curve lisce caratteristiche, fratture e rigonfiamenti.

Nella parte anteriore della nuova Infiniti Ku X 30 2017-2018, abbiamo un cofano leggermente abbassato con un leggero rilievo lungo i bordi, контакт с верхним бордом делла грилия дель радиатор. Quest’ultimo vanta una forma intricata, bordi argento e trama a rete nera e un logo imponente al centro.

Gli angoli del reticolo sono a contatto con l’ottica della testa aggressiva, simile agli occhi diabolici di un predatore. Lungo i bordi in basso ci sono piccoli rettangolari fendinebbia, tra cui è Inserito un Insert decorativo in argento, che ricorda la protezione sottoscocca con apertura a griglia.

Защитите Infiniti QX30 от новой корпорации, изогнутой формы и комплекта carrozzeria из защищенного пластика, не имеющего отношения к окружающей среде. Профильное приложение динамично грациозно Алла Линия дель Тронко инклината и Алла Линия аффузолата дель ветро.Il montante C curvo «rotto» sembra originale.

Probabilmente di all angoli, la nuova poppa QX30 2017 hail design complesso ericco. L’auto ha risvuto uno stretchto finestrino curvo, sul quale è appeso uno spoiler con luce di stop incorporated.

A forma di cuneo si trovano ai bordi luci posteriorila metà raggiunge il portellone. Il paraurti sembra impressionante, la cui parte inferiore è realizzata in argento — un paio di tubi di scarico retttangolari sono integrationti in esso.

Салон

Infiniti QX30 2017-2018 — кроссовер Compatto класса премиум и международная реальность. Предложение, созданное на основе дизайна, сделанного в прошлом году жертвователем Mercedes. Ci sono molte somiglianze tra i modelli dei due marchi, ma il «giapponese» ha alcune caratteristiche originali.

Рисование многоцелевого использования в гранулах и трэцз, привлекающих внимание к традиционному стилю управления: принципам работы, качеству и информативности отображения.

Различия между Mercedes и новой информационно-развлекательной системой Infiniti QX30 интегрированы с панелью и одновременно чувствительны. Предложение, это circondato da una plastica molto mediocre.

Сразу после того, как вы удалите вентиляцию, вы получите качественную единицу управления мультимедиа и другие функции. Следующие за звуком рипортаты я управляю климатом, и пой с’е ла zona di trasmissione orizzontale.

Davanti ci sono sedili molto comodi, che però, con una natura dinamica della corsa, non Possono vantare un appoggio laterale sicuro.La fila posteriore — это французская ангела, falsa razza crossover colpisce.

Характеристики

L’Infiniti QX30 — это внедорожник, подходящий для всех. L’auto ha quanto segue sizesi: Lunghezza — 4,425 мм, larghezza — 1,815 мм, altezza — 1,515 мм, passo — 2,700 мм. Этот песо в сумке составляет 1,542 кг и мешок объемом 430 литров.

Кроссовер Infiniti KX 30 2017 года имеет независимую поддержку: предыдущий тип McPherson и заднюю многорычажную связь.Freni a disco ventati su entrambi gli assi. Il modello monta cerchi da 18 pollici con pneumatici 235/50. Altezza libera dal suolo — 202 мм.

Nel mercato russo, la QX30 — это предложение с единственным бензиновым двигателем объемом 2,0 литра, который содержит 211 CV. e 350 Нм коппии. Мотор является одним из семи роботов-роботов Марсии с доппией и системой интеграции.

Prezzo в России

Test di Guida

Павел Карин ди Драйв.Кроссовер Infiniti QX30 и новая модель кроссовера Infiniti QX30:

В эффетти, оверклоке это чудо, с динамической солидарной динамикой — неи 7,3 секунды дичиарати. Fino a cento non ho dubbi. Скорость 130 км / ч составляет около 2.000 гири, это двигатель, это соображение, не является удачным, иль, что не может быть тяжелым движением с большим движением. Ротоли в «Драйве» 70 км / ч — на моторе, с прицелом, квази-аль-минимо. Se traduci in Sport, i giri salgono pi in alto del desiderato.

В эффетти, новом QX30 для davvero un buon lavoro in curva, rotola appena percettibilmente e scivola в modo prevedibile con tutte e quattro le ruote, ma lo sforzo di sterzata, sfocato e non puoi godertelo. Ma i freni ventati «in cerchio» sono decisamente ottimi: e il primo stick si fa sentire, e il dosaggio della decelerazione è chiaro.

Tattilmente si sente implicitamente, ma per la traiettoria in curva, Infiniti QX30 tiene saldamente a qualsiasi velocità Entro limiti ragionevoli.La Lamentela Principale — это комфорт, который доволен латеральным дизайном на открытом воздухе.

La sospensione è densa ed è per questo che al guidatore piace più dei Passeggeri: sente che tra il corpo e le ruote non ci sono archi tremanti, ma i muscoli sono in buona forma, e quindi si excita coraggiosamente su quasi de la maggior irregolarità. Я compagni non provano disagio, ma su tutte le buche, ad eccezione di quelle che потенциально assorbire pneumatici da 18 pollici con un profilo del 50%, esce lo scuotimento laterale.

Avrebbe potuto essere meno invadente se Infiniti non avesse Inseguito gli pseudo-sport. È Positivo Che la Cabina sia Silenziosa e вероятностная система отмены слухов.

Внедорожник Infiniti QX55 — это великий естественный автомобиль, созданный в 2004 году. Авто был создан на платформе Nissant Pathfinder Armada. Entrambe queste macchine vengono costruite nel nuovo stabilimento di HMC a Canton, Mississippi, USA.Этот дизайн авто является базовым для тела длинного типа chiuso. Эта модель Infiniti QX 55 использовала предыдущую и заднюю независимые … Для автомобиля установлена ​​новая двигательная установка V8 DOHC объемом 5,6 литра с 340 каваллией. Мотор, похожий на виену, был использован в Pathfinder Armada и в пикапе Nissan Titan, который является грандиозным естественным автомобилем. Inoltre, авто — это система интегрированного перевода Shift-On-The-Fly. …

L’Infiniti QX56: полноразмерный внедорожник — это автомобиль, созданный специально для североамериканского континента.Автоматическая позиция поставляется с лучшей версией, более высокой и качественной. Nissan внедорожник Pathfinder Armada. Другой автомобиль — пикап Nissan Titan. Infiniti QX 56 представляет собой статую презентацию для первого автомобильного салона в Лос-Анджелесе в 2004 году. В 2006 году был произведен рестайлинг в 2007 году в России. Интересно, что вы можете использовать русский язык только с одной версией интегрального перевода QX56. Negli Stati Uniti является одним из вариантов последующего перевода.В марте 2010 года дебютировал второй генеральный внедорожник премиум-класса. Авто sulla sulla base di Pattuglia Nissan 2010. Это модель, которая гуадагнато в лунгхецце и большом количестве, ма è diventato tozzo. Доступна версия для набора и отправки сообщений Infiniti QX56. Авто 2011 года оснащено двигателем V8 объемом 5,6 литра, имеет потенциал 400 каваллов. Accoppiato con un sette velocità trasmissione Automatica il motore in Grado di Accerare l’auto 100 км / ч за 6,5 секунды.

Nell’aprile 2010, Infiniti имеет новую версию кроссовера Grandezza naturale QX56.В первую очередь, авто — это статуя на Нью-Йоркском автосалоне и в объявлениях о Салоне Моска. Это различное предыдущее поколение, которое является созданным на базе Nissan Armada, новым внедорожником и созданием нового поколения Nissan Patrol. Inoltre, внедорожник премиум-класса, имеет большую высоту и высоту, имеет базовую высоту 10 сантиметров и высоту до 22 сантиметров. Allo stesso tempo, l’altezza dell’auto — это уменьшение мгновенно на 8 сантиметров.Esternamente, l’Infiniti QX56 является аналогом своего прототипа соло с fianchi della carrozzeria. La parte anteriore e quella posteriore dell’auto sono Rese più sportive. Equipaggiamento tecnico Il QX56 viene copiato dall’allestimento premium della Patrol. Двигатель V8 установлен в автоматическом режиме, имеет потенциал 405 каваллов и лаворанов в сочетании с автоматической камерой и 7 велотренажерами. Интегрированная система перевода представляет собой режим полного привода All-Mode-4WD. Принципиальные характеристики системы Hydraulic Body Control Motion, которая стабилизирует автомобиль на высокой скорости.Внедорожник получил транспортное средство от Nissan Patrol. Салон Infiniti QX56 2011 разработан специально для персональной установки и имеет более низкую версию, а базовая часть окрашена в гранулы. …

Specifiche Infiniti QX56

Семейство автомобилей

SUV

• larghezza 2030 мм
• Lunghezza 5290 мм
• altezza 1920 мм
• altezza da terra
31 мм

Новый внедорожник Infiniti стал ярким и реалистичным внедорожником.Дебютный день наступил 29 ноября все популярное большинство мондиальских дней, которое произошло в Лос-Анджелесе в 2017 году.

Nuovo модель Infiniti QX50 2019-2020

Модель — это средние размеры с внутренними соответствиями. L’Infiniti QX50 2 2019-2020 модельного года unisce eleganza, praticità e muscolosità. Diamo uno sguardo pi da vicino all caratteristiche e all novità apparenza esterna premiere Infinity.

Gli sviluppatori hanno fatto del loro meglio sulla loro idea e hanno creato una novità alla moda e alla moda, который содержит такие элементы дизайна в ombra anche le opzioni più popolari dei Principali concorrenti, anch’esse state agiornate.Il carisma delle nervature sul cofano e nella zona dei fianchi conferisce luminosità all’auto, i fari installati, che sono responsabili del faro, sono dotati di LED.

Задняя перспектива делла Нуова Infiniti

C’è una griglia in testa, che è un marchio. Предыдущие параметры нового Infiniti KuX 50 имеют определение для присутствия большого числа частей аэродинамических характеристик, уникальных по … Gli esperti chiamano i ritagli per i passaruota semplicemente great e caratteristica se уверен, что одна линия пиластроата в четырехугольнике.

Le luci di posizione con led e il paraurti dotato di element agiuntivi (tubi di scarico) sotto forma di un trapezio. В общем, дизайн dell’auto nella nuova carrozzeria esprime la sua Individualità, Potenza e mascolinità con una mancanza di aggressività.

Gli interni dell’Infiniti QX50 2018 звучит как часть разговора, особенно если вы хотите узнать, что такое современный и азиатский стиль. La decorazione degli interni colpisce per la sua originalità, это многоцветный продукт, использующий пелле высокого качества из разнообразных сортов.La decorazione contiene anche elementi in legno, plastica morbida di alta qualità, piccoli dettagli in alluminio cromato.

салон Infinity CuX50 2018

Questa combinazione di materiali crea interni unici e delizia anche i giornalisti automotivei pi esigenti. Пелле используется для всех внутренних элементов: воланте, паннелло, порте, браччиоли, седили и персино иль помелло дель камбио.

Модель представляет собой современный атрибут, который способствует заметному развитию процесса руководства внедорожника.Sono stato colpito da una funzione interessante: un proiettore che ha la capacity di visualizzare le informazioni richieste sul vetro proprio davanti al guidatore, cioè il parabrezza.

Certo, c’è un azionamento elettrico, comode sedie. I Passenger nell’ultima fila Possono sperimentare il movimento originale intorno alla cabina utilizzando una slitta unica.

Grazie all’aggiornamento della piattaforma, новая модель L’Infinity CuH 50 2018-2019 ha completetamente cambiato le sue proporzioni.Премьера — это заметный размер, размер которого составляет 51 мм, размер больше, меньше, меньше 102 мм. Анче в altezza l’auto è aumentata di 64 mm, ma gli sviluppatori hanno ridotto il passo di 80 мм.

Di conguenza, abbiamo appreso le seguenti Dimensions:

• Lunghezza — 469,4 см;
• Larghezza — 190,2 см;
• Altezza — 167,9 см;
• Passo 280 см около;
• L’altezza da terra è di 21,8 см.

Новое поколение черт в легковом стиле, диаметром от 19 до 20.

Для производства нового корпоративного внедорожника, используется сверхпрочное масло с повышенной устойчивостью — около 980 МПа. Il peso della carrozzeria stessa senza attrezzature agiuntive e verniciatura è di около 419 kg и anche il suo livello di rigicità è aumentato del 23 процентов.

За количество сумок Infiniti QX50 2018, имеющее емкость в 895 литров, можно было сделать это лучше всего.Quando i sedili sono ribaltati, questo volume aumenta fino a 1.048 litri.

Модель доступна в различных вариантах оснащения. Базовая конфигурация — внутренняя часть в пелле, электронном и рискалдном, импианто аудио, климатизаторе. Il prezzo comprende anche la verniciatura in un elegante colore Metallizzato, cerchi in alluminio, tettuccio apribile, accesso al motore senza chiave di acnsione, alzacristalli elettrici, specchietti riscaldati.Установите различные системы, которые управляют движением.

Come opzione agiuntiva, si propone di simulare il movimento di un’auto e trasferire queste information sotto forma di un’immagine virtuale su un grande schermo, che viene mostrato in modalità a colori. È inoltre возможность установить сенсорные элементы и avvisi sulla situazione sulla strada.

Конкретный Infiniti QX50

Кроссовер второго поколения, оснащенный бензиновым двигателем и двигателем VC-Turbo с объемом 2,0 литра.Потерянный автомобиль 272 … Модель с фронтальным двигателем или quattro с двигателем, движется на скорости до 230 км / ч. L’accelerazione 100 chilometri viene eseguita in soli 6,7 secondi per il pieno e in 6,3 secondi per trazione anteriore … Cento chilometri di strada richiedono 8,6-9,2 литра.

Мотор, который функционирует должным образом, изменен без одиночной компрессии, имеет объем от 1997 см3 до 1970 см3, после сжатия и регулируется с 14: 1 до 8: 1 в секунду.

Una delle caratteristiche dell’auto — это презентация интеллектуального руководства. Вы можете выбрать один из нескольких типов мультидисковых фризонов, который вам понравится, и вы получите желаемое из карбюратора.

La sospensione indipendente davanti a un montante di tipo McPherson e un multi-link nella parte posteriore.

Prezzi Infinity KuX 50

Поставщик автомобилей в России, начатый 1 августа 2018 года. Строгое поставка своей конфигурации и далекой настройки.È:

Все кроссоверы сделаны без единой интеграции.

Видео тест-драйв Infiniti QX50 2019-2020:

Новая модель Infiniti KuX 50:

Dipendenti esperti e la nostra base materiale e tecnica ci согласен с эффектами автомобиля Infiniti QX находится в Mosca и nella region di Mosca, sia в других регионах.Federazione Russa … Collaboriamo con clienti private, piccole imprese e grandi imprese. Все наши клиенты рисуют в отдельном порядке, находящемся ниже, в отдельном разделе, посвященном системе обслуживания: l’acquisto di un’auto Infinity KuH.

Acquistare un’auto da noi richiede solo quattro passaggi:

1. Stai richiedendo un servizio: riscatto automatico di Infinity KuH.
2. Usciamo e valutiamo i veicoli in modo obiettivo.
3. Tu fornisci i Documenti, noi li legalizziamo.
4. Ottieni soldi, siamo un veicolo.

Если вы хотите купить Infiniti QX без уведомления? Questa è, prima di tutto, l’efficienza di tutte le azioni. Oltre a pratiche burocratiche informità con la legalazione esistente e riszione di un calcolo in una forma comfortiente. Decidendo ди Vendere Infiniti KuH профессионально, это защищает от всех ситуаций forza maggiore, которые неизбежно производятся в зависимости от того, что вы делаете в одиночку.

Интернет-магазин автомобилей Infiniti KuH с подключением к сети

Стоимость операций — автоматическое приобретение Infiniti QX, является индивидуальным стимулом для всего производства, технического обслуживания и вторичного рынка… Scopri il costo optimato della transazione — riacquisto auto Infiniti QX, puoi utilizzare un comodo servizio: la valutazione rapida online, disponibile 24 or su 24. Это предложение может быть принято: Vendere или no? Ma credimi, utilizzando i servizi del nostro servizio, risverai l’offerta più vantaggiosa.

Facciamo un acquisto urgente di Infiniti KuH con qualsiasi проблема, chilometraggio elevato, garanzia e credito, utile e nemmeno in movimento. Evacuiamo noi stessi i veicoli non trasportabili da qualsiasi parcheggio, e in modo completetamente gratuito.Il riscatto delle auto usate per noi è un lavoro quotidiano Che svolgiamo semper ai massimi livelli. Свяжитесь с нашим центром и помощником по всему миру!

Nel 2019 dovrebbe entrare nel mercato la nuova Infiniti QX70 e ci proponiamo di valutare quali saranno gli esterni e gli interni della novità basati sulla prima foto del modello, e anche di scoprire, cosa specifichev del modello, e anche di scoprire, cosa specifichev, opzioni noverdi avan lusso.

История модели

Infinity — это дочерняя компания Nissan, созданная специально для автомобилей премиум-класса.QX70 — это кроссовер премиум-класса с пятью средними размерами, которые являются наиболее популярными для первого поколения 2002 года. В 2013 году он был произведен вторым поколением автомобилей.

Основные преимущества, которые интересны для автомобилей:

• sicurezza;
• комфорт;
• dinamica;
• aspetto;
• pervietà;
• престиж.

Подготовка новой версии Infiniti L’anno modello QX70 2019 указана начальная фотография обновленной версии кроссовера в многочисленных опубликованных автомобильных версиях полностью.Successivamente, la società ha confermato le informazioni sullo sviluppo della prossima modifica dell’auto di lusso.

Esterno

Модифицировано для Infiniti QX70 2019, если вы хотите увидеть новые фотографии кроссовера. Дизайн обновленной версии является значительным разнообразием авто второго поколения.

Существенные значения камбайамента в предыдущей части, означающие, что реализовано, когда проект был реализован, с лучшими планами:

• una griglia del radiatore esagonale in un’ampia cornice leggera con un logo asiendale ingrandito;
• Оттиче растяжки L в версии светодиода;
• elemento massiccio di protezione inferiore;
• un paraurti a gradient con nicchie trapezoidali dei fendinebbia;
• feritoie verticali delle prese d’aria laterali.
• passaruota alti;
• una linea del tetto liscia che si fonde con uno spoiler posteriore pulito;
• binari superiori compatti;
• timbratura su porte e paraurti con un motivo veloce.

La parte posteriore dell’auto is formata da:

• portellone bagagliaio a gradient con ampie luci a LED;
• diffusori di scarico grandi e di colore chiaro include nella protezione sottoscocca scura;
• lunotto con forte pendenza.

Interni

Новый интерфейс Infiniti QX70 2019 соответствует требованиям, предъявляемым к автомобилю премиум-класса, и создан для комфорта, уровня комфорта и архитектуры. Центральная консоль более информативная, ее дизайн — это реалистичная форма, созданная специально для вас. Allo stesso tempo, in alto si trova un cruscotto digitale e un monitor a colori del complesso multifunzionale, protetto da una lunga visiera antiabbag охраной.Sul livello successivo ci sono i diffusori attrezzatura climaticae un vano portaoggetti si trova nella zona più bassa.

Inoltre, l’interno dovrebbe essere Evidenziato

• volante sportivo multifunzione;
• comode sedie con appoggio laterale;
• туннель передний compatto con selettore marce, bracciolo e vano portaoggetti Refrigerato.

I sedili posteriori hanno nuovo design, che ha permesso di rendere l’interno pi spazioso.Inoltre, hanno la possibleilità di regolare lo schienale separatamente. Inoltre, я сделал возможным essere ripiegati in un rapporto 60/40 formando un pavimento piatto, che non solo aumenta le sizesi del vano bagagli, ma fastena anche il carico (scarico).

Nel design nuova Infiniti QX70 2019 с использованием материалов:

• vera pelle;
• Inserti in legno lucido;
• alluminio spazzolato;
• pelle scamosciata;
• отделка хромат.

Технические характеристики и атрибуты

Размеры кроссовера:

Для комплектного кроссовера, который может быть показан заранее и следуя за двигателями:

Для передачи интегральной траектории, которая была создана автоматически с помощью 7 марта.

Tra le varie dotazioni moderne del crossover, si segnalano:

• richità variabile delle sospensioni;
• vista a tutto tondo;
• controllo del parcheggio auto;
• controllo climatico;
• navigazione;
• regolazione automatica della velocità;
• Информационно-развлекательный комплекс с дисплеем для 9 пользователей;
• illustazione adattiva della testa;
• Ruote da 21 pollici;
• blocco porte dall’aperturaidentsale;
• новая подушка безопасности и подушка безопасности тендина;
• poggiatesta attivi;
• blocco pedale regolabile;
• apertura a distanza del bagagliaio;
• controllori pressione pneumatici, pioggia, luce;
• ретратиль лавафари;
• alzacristalli elettrici;
• chiudiporta elettrico posteriore;
• sedili anteriori regolabili в 8 позициях, рискованные и электрические;
• rivestimento del corpo autorigenerante (vernice antigraffio).

Последний финал всех доступных аппликаций, созданных при помощи оригинальных приложений для кроссовера.

Прежде чем новый Infiniti делла более высокий класс, конкурирующий с популярными моделями:

1. Cadillac SRX;
2. Lincoln MKX;
3. Порше Кайен;
4. BMW X5.

Inizio delle vendite

Новые коммерческие российские модели Infiniti QX 70 были установлены на всех устройствах 2019 года.Secondo i dati preliminari del produttore, per gliakennti domestici, la novità manterrà le designazioni esistenti delle opzioni di configurazione. Первоначально, «Премиум», цена за 3 миллиона 650 миллионов рублей.